乔纳斯·科拉赫在给我讲故事。
这是他如何帮助开发单分子实时测序(SMRT)的故事，该技术已成为基因组学的主要技术，在1400多年中出现出版物仅在2017年。Korlach现在是首席科学官太平洋生物科学(PacBio)坚定地认为SMRT是测序研究的前进方向。Korlach是如何将SMRT从笔记本上的一个想法变成一项成熟的基因组技术的?
水晶革命
故事要从1997年康奈尔大学说起。科拉赫当时还是研究生一年级，在杰夫·罗伯茨(Jeff Roberts)的指导下学习了生物合成和大分子的课程，罗伯茨现在是康奈尔大学分子生物学和遗传学系的罗伯特·j·阿佩尔教授。“90年代末期是分子生物学领域一个非常激动人心的时期，”科拉赫说。“所有这些论文都是关于高分辨率晶体结构的，所有这些大分子机器。
这是一场革命，因为之前，我们在大学期间研究的都是凝胶上的条带，你必须间接推断才能弄清楚这些酶是如何工作的。现在被这样的图片所取代，”他指着下面的图片说，这是20年前发表的一篇论文中T7 DNA聚合酶的晶体结构。这绝对比凝胶上的带子进步了。
“我们现在对这些分子的形状和几何结构有了很好的理解，这让我感到非常兴奋。”
但分子并不是静止的，即使是最详细的图像也无法提供分子在细胞中实际如何运作的信息;基于晶体结构的动画试图展示分子的运动，但这些动画中的运动都是科幻小说。科拉赫认为，研究可以朝着更好的方向发展。
分子机器运动
科尔拉赫说:“我对如何能够实时观察这些令人难以置信的大分子机器产生了兴趣，这些机器执行着生命运转的基本过程，并试图弄清楚这些东西实际上是如何实时移动的。”他决定从研究生物学中最令人印象深刻的“机器”之一——DNA聚合酶分子开始。DNA聚合酶的任务是复制DNA分子，使用已有的分子作为模板。鉴于我们的DNA是我们遗传密码的完整基础，聚合酶必须能够在几乎没有错误的情况下以令人难以置信的速度完成这一过程。
Korlach对聚合酶的表现感到惊讶:“它经过了数亿年的进化，它非常精确，它是高度加工的。很明显，它可以“排序”，也就是复制基因组中的所有碱基，否则我们就有大麻烦了。它没有任何偏差，速度非常快，在你体内这个过程以每秒1000个碱基的速度进行。它非常节俭，它只需要一个核苷酸就可以通过GC/AT碱基配对来解码另一边的东西，而且它的体积非常小，所以它可能会在很小的占地面积上实现很高的多重复用。”
Korlach总结说，如果你能看到DNA聚合酶在进行它令人难以置信的、进化辅助的工作，那么你就可以简单地让酶来做繁重的工作，并记录它的表现，从而创造出一种高质量的测序技术。
在当时，这更像是白日梦，而不是实际的计划。现有的显微镜只能观察到至少500个聚合酶分子，产生了令人难以置信的混乱信号，这将掩盖实际的测序过程。
幸运的是，Korlach有一个好伙伴。他的博士导师是瓦特·韦伯，这位开创性的生物物理学家已经因为创造了另外两种分析技术而闻名于世，荧光相关光谱而且多光子显微镜当时科拉赫加入了他的实验室。韦伯帮助科拉赫与史蒂夫·特纳(Steve Turner)展开了对话，特纳是世界领先的纳米制造专家哈罗德·克雷格黑德(Harold craighhead)隔壁实验室的一名研究生。特纳现在是PacBio的首席技术官。这引发了一系列实验，目的是制造一种实际上比目前可用的任何显微镜都强大1000倍的显微镜。经过多次尝试，最终的结果是zero-mode波导这是PacBio测序技术的基础。
纳米显微镜
“零模波导是你能想象到的最简单的纳米结构之一，”Korlach说。他离我们不远了。从本质上讲，ZMW是铝金属片上的一个令人难以置信的小洞，直径只有150纳米。一根人类的头发大约是75000纳米。这是个非常小的洞。
但是一个小孔(不可否认，非常非常小)是如何制成一个可行的显微镜的呢?科拉赫提出了一个相当出色，但出乎意料的类比;厨房里的微波炉:“你知道你的微波炉门上有一个有洞的金属屏吗?这样做的目的是，你可以透过微波炉的内部，看到你的食物在煮，但金属屏幕可以防止微波辐射出来，把你烤熟。”微波是电磁波谱的强大保护者，波长在厘米范围内。科拉赫解释说，这些厚波根本无法通过烤箱纱门上的小孔，而且在击中它后会呈指数衰减，而波长相对较薄的400-800纳米的可见光可以很容易地从微波炉内部通过纱门反弹到你的眼球，这意味着你可以很高兴地拉起一把椅子，看着你的晚餐在这个过程中被融化。
不幸的是，可见光正是需要用科拉赫显微镜观察到的，这意味着需要一个非常小的微波门。零模波导本质上就是微型微波门。在ZMW内，DNA聚合酶分子与待测序的模板DNA一起被吸附到碱基底部，附着荧光分子的核苷酸被释放到ZMW室中。就像我们的微波门屏一样，ZMW的微小孔径阻止了从下面照射到ZMW的光线穿过。相反，衰减的光只能到达检测室的最底部，这意味着只有DNA聚合酶分子和目前附着在它上面的碱基才能被照亮和检测。这意味着波导室可以充满核苷酸，但只有在一个zeeptoliter(10-21)体积内的核苷酸是可见的。如果组成DNA的4个碱基都可以用不同的荧光颜色标记，那么通过读取荧光碱基被光源击中时出现的彩色闪光，就可以破译相应的碱基。
固定荧光
问题解决了吗?不完全是。Korlach制作的荧光标签可以将固定在碱基分子上的碱基可视化，其位置与聚合酶的位置大致相同，这大大降低了测序过程的效率。此外，即使聚合酶已经添加到碱基上，并转移到下一个核苷酸上，荧光标记也会保持附着-快速地用不需要的颜色填充ZMW的腔室。这个问题需要一个非正统的解决方案，所以Korlach接下来告诉我的似乎非常合适:“所以我在圣达菲的一家印度餐馆里想到了一种不同类型的核苷酸。”虽然Korlach并没有在餐巾纸上写下解决方案，但他很快就在笔记本上勾勒出了答案:“我意识到，检测的另一种可能性可能是荧光团附着在碱基分子的另一端。”这种新位置阻止了荧光标签阻碍聚合过程，也允许标签在聚合发生后飘走。
smrt测序吗?
科拉赫让这一切听起来很简单，但很明显，多年的工作已经在完善这项技术。PacBio已经非常简单详尽地描述和调整他们的核苷酸、聚合酶和荧光团，以生产一种商业产品。PacBio公司的最新产品Sequel系统拥有100万个这样的潜在测序位点，可以产生基因组数据的光影秀。当然，PacBio在测序市场上并不孤单，Korlach似乎对他的SMRT技术与竞争对手技术竞争的潜力充满热情。当然有很多研究人员同意他的评价。近年来，SMRT测序越来越受欢迎，并已在著名的研究中投入使用，包括高调描述猿而且考拉基因组，甚至被用来戳洞，备受赞誉CRISPR基因编辑技术。
Korlach认为，他的技术令人兴奋的地方在于它在几个测序参数上的一致表现:“在测序中，无论何时评估任何测序技术，都有四个不同的标准，真的，我在这里列出了它们。你想问，“读取多长时间?”读取的准确性如何?是否存在偏见?这些方法能检测出化学修饰吗?”
Korlach说，只有在他花了几十年时间研究的聚合酶的帮助下，才有可能实现这些标准:我们20年前最初的希望，现在已经实现了，因为DNA聚合酶的特性，我们在这四个领域同时为客户提供了最好的性能。”
