琼脂糖凝胶电泳,它是如何工作的,其应用范围

简单的物理定律支配,当电流应用中包含指控物种,这些物种将向相反的电荷迁移。根据媒介它们移动,其他特征,如大小的物种——会影响他们的运动,导致分离。这是电泳的基础技术,如琼脂糖凝胶电泳、构建技术,广泛应用在生命科学。

在本文中,我们将考虑琼脂糖凝胶电泳是如何工作的,如何解释它和它的一些目的。

电泳是什么?

电泳是一种技术,它使用电流分离DNA, RNA和蛋白质基于他们的物理性质,如大小和电荷。

琼脂糖凝胶电泳是什么?

琼脂糖凝胶电泳是一种电泳用于核酸(DNA或RNA)的分离碎片根据他们的大小。带负电荷的DNA / RNA迁移通过琼脂糖凝胶的孔隙对带正电的凝胶应用电流时,较小的片段迁移速度更快。由此产生的乐队可以可视化使用紫外(UV)光。

RNA,¹然而,往往会形成二级结构,有时多个不同物种相同的片段——影响迁移的方式。因此,观察到乐队并不总是代表自己的真实大小和图像是模糊的。本机琼脂糖凝胶(条件不破坏的自然结构分析物)因此往往不会被用于分析RNA大小,虽然他们可以给一个估计的数量和完整性。备选方案包括northern变性琼脂糖凝胶电泳²使用条件能够扰乱二级结构。

琼脂糖凝胶还可用于分离蛋白质³根据它们的大小和电荷(与DNA / RNA、蛋白质负责根据不同氨基酸结合)。然而,由于大孔隙的大小在琼脂糖凝胶,蛋白通常分开聚丙烯酰胺凝胶有小毛孔相反,提供更大的分辨率小的蛋白质分子。

因此,我们将专注于DNA琼脂糖凝胶电泳对本文的剩余部分。

凝胶电泳是如何工作的呢?

琼脂糖琼脂是一个组成部分。它形成一个3 d的螺旋琼脂糖凝胶基质分子氢键在超螺旋束,与渠道和分子能够通过毛孔。当加热时,这些氢键断裂,将琼脂糖液体,允许它注入模具之前重置(图1)。

图1: 在琼脂糖凝胶孔隙的形成和温度引起状态转换。

的琼脂糖的比例包括在凝胶孔隙的大小,从而影响分子的大小可以通过和速度。琼脂糖的比例越高,孔径越小,因此,小分子能够通过和迁移越慢。的分子生物学实验室,0.7 - -1%琼脂糖凝胶通常用于日常DNA分离,提供良好、清晰的差异化碎片在-10年0.2 kb。大片段可能解决使用凝胶比例较低,但他们变得非常脆弱,很难处理,而凝胶将更好地解决小片段的比例更高但脆弱,可能设置不均匀。

DNA是肉眼不可见的,置入一个染料等溴化乙锭(EtBr)纳入凝胶在设置。这结合DNA和迅速膨胀紫外线照射下,允许可视化的DNA片段。DNA存在越多,光明的乐队。

样品与加载染料混合放置在凝胶的一端是沉浸在运行缓冲。然后电流通过电极两端的凝胶的凝胶槽(图2)。

图2: 琼脂糖凝胶电泳的插图设置。缓冲区的琼脂糖凝胶坐在一辆坦克,样品与加载染料混合凝胶的一端放置在井和一个电流应用导致了带负电荷的DNA走向正极(阳极[更新,2023年2月13日])。

当样本运行不足以获得足够的分离,这种凝胶从坦克和删除放在一个紫外线的盒子。然后再染料允许可视化示例乐队和他们的大小决定相比,DNA梯与已知的带尺寸。在非线性迁移距离和片段大小之间的关系,增加的重要性包括大小标记作为参考(图3)。

图3: 一)上面的插图描绘了一个典型的DNA电泳的结果。在左边,有尺寸标记作为参考样本DNA片段的长度(碱基对)。右边的标志有三个样本:样本,样本B和c的图像显示了更小的DNA片段进一步通过比大片段DNA琼脂糖凝胶。B)图右边的图片显示的是非线性,DNA片段的大小之间的关系和迁移的距离。它是负的曲线,随着DNA片段的变大,他们通过凝胶少迁移距离。来源:Mckenzielower,复制Creative Commons Attribution-Share都4.0国际许可证。

DNA凝胶电泳步骤,凝胶电泳机、电泳缓冲和电气隔离

有一些关键步骤⁴参与选择、设置、运行和分析琼脂糖凝胶,现在我们将考虑。

1。确定所需的凝胶百分数- 0.7- - - - - -1%琼脂糖凝胶通常是足够的对于大多数应用程序,但重要的是选择一个适合您的样本比例和预期片段大小。结合琼脂糖粉和相同的缓冲类型被用来运行凝胶和热融化混合物,避免沸腾。Tris-acetate-ethylenediaminetetraacetic酸(EDTA) (TAE)或tris-borate-EDTA(此种)⁵通常选择的缓冲,tris-acid解决方案有效的缓冲略基本条件,保持DNAdeprotonated溶于水。EDTA,一种螯合剂核酸酶灭活,可能损坏DNA被分析。

2。倒胶——选择一个凝胶铸型和梳子所需的大小,给予足够的油井数量为所有样本和梯子和能力持有加载每个样本的数量。安全开的模具,铸造框架或磁带包含凝胶虽然集。添加DNA插层染料模具的底部——EtBr, 0.2 - -0.5µ通常使用g / ml。证据表明EtBr仍然是诱变剂目前讨论但因此,许多实验室已经替代⁶比如GelRed。添加凝胶,注意不要往模具,而且确保插入染料均匀混合。不要把凝胶当它太热或模具可能变形或破裂。

3所示。混合样品/梯子与加载染料- - - - - -加载染料执行多种功能。他们允许用户看到否则无色样品,使其更容易吸管样品到准确,从而减少交叉污染的可能性之间的样本井。凝胶正在运行时,染料迁移样本,允许用户告诉在凝胶样品已达到和阻止它运行得太远迷路到缓冲区。DNA样本没有染料也会倾向于分散加载到运行缓冲时装载密度较低。因此大多数加载染料含有甘油或聚蔗糖使sample-dye混合密度,因此解决油井的底部。溴酚蓝是一个受欢迎的着色剂的选择,但有些还包含额外的染料如二甲苯苯胺。而加载染料可以购买,许多实验室做出自己的选择。⁷

如果您正在运行非常小的样本(例如,小于5µl),它可能有利于增加一点水在这个阶段,让它更容易加载凝胶井有效并均匀。同样,如果你希望在一些样品DNA的浓度远远高于别人,也可能需要添加水sample-dye混合浓缩样品在这个阶段。如果不这样做,这些乐队的强烈信号在可视化可以掩盖弱乐队或需要在暴露于强烈的乐队观点较弱的人,创造明亮、扭曲变形的区域在凝胶图像。

4所示。加载凝胶-消除铸造框架/磁带从凝胶的凝胶,并将其集箱,确保井处于负电极(黑色)。填满罐运行缓冲(TAE或此种)凝胶被淹没。小心地把梳子轻轻地吸管sample-dye(如果使用)和水混合入井。尽量避免接触的边缘井与吸管提示他们可能打破,允许一个示例运行到下一个。重载井可以有相同的结果。大量的DNA也可以减缓DNA迁移期间运行。负载标记梯子,最好是一个两端的样本行。凝胶可能并不总是运行在一个完美的直线因此梯两端可以更容易地确定碎片的大小。各种各样的梯子用不同大小表示可用;选择一个最适合你期望看到的片段大小。

5。运行凝胶——把盖子放在电极的坦克黑色到黑色和红色,红色和电极插入电源组,还黑,黑和红红。随着凝胶坦克,这构成凝胶电泳机。确保周围的电极和盖子是正确的方法否则你的样品会向后的井和运行缓冲。设置时间和凝胶将会运行在电压;120 V 35分钟是一个很好的近似,不过这应该是适合使用的凝胶百分数和预期片段大小被分离为好电分离。应用当前的琼脂糖凝胶将导致升温,电压越高越会热凝胶比例不足时,建议使用低电压,以防止融化。它可以容易增加电压凝胶跑得更快。然而,这可能导致“笑脸凝胶”,乐队的两端是向上弯曲的,难以确定正确的乐队的大小。这就是凝胶略有开始融化使乐队运行不均衡。这也会导致乐队出现油污及定义。

6。可视化——一旦样品运行大多数的凝胶(染料方面将使这个可见),关掉电源。戴着手套,轻轻地去除凝胶在模具的坦克,消耗掉多余的缓冲,并转移到可视化的紫外线框在一个适当的容器。改变手套,以防止污染周围的表面,门把手等置入与染料从凝胶或运行缓冲。如果下游应用程序所需的DNA片段,相应的乐队可以仔细切除从凝胶手术刀叶片同时放在一个紫外线框在一个黑暗的房间。确保你穿紫外线面罩和保持皮肤覆盖在灯箱上,以防止损坏你的皮肤或眼睛的紫外线。

凝胶电泳怎么读吗

琼脂糖凝胶可能可视化在紫外线框在一个黑暗的房间或使用一个独立的灯箱与相机有关。哪个系统是利用,紫外线照射通过DNA凝胶从下面和乐队的置入发出荧光的染料绑定。这可能是使用了摄像机与专门的紫外线过滤你的记录。标记梯子有导游来表示每个乐队的大小包括。通过比较这乐队样本内车道,乐队的大小因此可以确定。之间的相对数量的DNA样本也可以比较,随着更高的DNA浓度会产生光明的乐队。一个例子就是如图4所示。

图4: 琼脂糖凝胶(2%)分析扩增产品从DNA提取菌进行支气管肺泡灌洗(BAL)诊断肺部症状患者的标本。来源:美国疾病控制和预防中心。

凝胶电泳的目的是什么?

有许多原因的分离DNA片段可能是可取的,其中许多是广泛适用的整个生命科学学科。让我们考虑一些常见的目的。

• 可视化的DNA样本
  分离和可视化DNA片段允许用户确定:
  
  是否在现场留下的DNA样本——这可以证实,例如,如果一个DNA提取或聚合酶链反应工作和上下文中的诊断测试因此可以确定样品是积极的还是消极的。
  
  DNA片段的大小——如果执行PCR或限制消化,例如,预期大小的乐队吗?这可以证实如果基因工程实验成功或可能表明存在与否的基因插入,删除⁸或重复区域⁹作为诊断工具,可以用于一些遗传疾病。当DNA准备新一代测序,重要的是支离破碎的DNA库的准备是高效测序正确的大小。
  
  DNA的数量——尽管有更准确的方法精确DNA量化,¹⁰如紫外可见光谱在凝胶上运行样本时,乐队的强度产生可以给一个粗略的DNA样本的数量相对于其他样本。
  
  多么干净的样品——虽然抹乐队可能会在某些情况下,例如当运行整个基因组DNA,一个清晰的、脆乐队可能通常会从一个PCR或限制消化。扩散乐队或涂片可能表明PCR条件不佳或引物,不完整的消化或干扰的存在污染物如RNA的DNA样本。
  
• 分离纯化的DNA片段
  下游应用程序所需的DNA片段,比如克隆,¹¹或以下限制消化,它可能是可取的分离DNA片段的具体尺寸,从别人的总样本。为了达到这个目标,消化或放大样品可能运行在一块凝胶,凝胶包含感兴趣的碎片切除。清理工具和协议^12,13可用于净化DNA琼脂糖凝胶在继续之前的下游步骤。
  
• 南部分离DNA片段的印迹
  南部的印迹技术用于检测样品中特定DNA序列。为了做到这一点,首先DNA片段被琼脂糖凝胶电泳分离后可以探测目标序列。
  
• 电泳迁移率改变分析(emsa)
  EMSA,¹⁴也称为凝胶转变化验,是用来检测蛋白质和核酸之间的相互作用。例子可能包括的绑定转录因子¹⁵促进或阻止基因表达。当蛋白质结合的DNA片段,它将改变它通过琼脂糖凝胶迁移,产生一个“转变”。因此,通过运行不同的DNA片段组合有或没有一个公认的DNA结合蛋白,可以确定当绑定或尚未发生,从而确定目标序列。

DNA琼脂糖凝胶电泳术语表

术语	定义
琼脂糖凝胶电泳	一种电泳用于大分子的分离,如DNA片段,琼脂糖矩阵。
螯合剂	一种化合物能够与金属离子形成稳定的水溶性金属配合物。
变性琼脂糖凝胶	琼脂糖凝胶运行条件下破坏的自然结构DNA, RNA和蛋白质,使它们展开。
去质子化	删除一个质子(H+)。
DNA梯梯/标志	已知大小的DNA片段的溶液可以用来推断碎片在未知样本的大小。
电分离	生物分子的分离,如DNA、RNA和蛋白质,根据他们使用的电流大小和/或费用。
电泳	技术,使用电流分离DNA, RNA和蛋白质基于他们的大小和电荷等物理性质。
电泳迁移率改变分析(EMSA)	也称为凝胶转变化验,emsa electrophoresis-based技术用于检测蛋白质和核酸之间的相互作用。
凝胶电泳机	设备用于执行通常由一个凝胶的凝胶电泳槽,与电极连接电源组。
插层染料	染料结合的双链DNA,使它们在紫外光照射下可视化。
加载染料	染料用于准备梯子和DNA电泳样品,使他们能够用肉眼看到,增加他们的密度,防止扩散。
诱变剂	化学或物理现象,促进DNA复制错误。
本机琼脂糖凝胶	琼脂糖凝胶条件下运行,使保护自然结构的生物分子如:DNA、RNA和蛋白质。
北部的污点	技术用于检测样品中特定的RNA序列为样本,采用电泳分离。
核酸酶	核酸酶切割如DNA或RNA。
聚丙烯酰胺凝胶电泳	一种电泳用于大分子的分离,如核酸和蛋白质,在丙烯酰胺聚合矩阵。
限制消化	使用DNA酶切的过程在特定网站根据周围的DNA序列。
运行缓冲	缓冲区用来填补的坦克凝胶浸,并将运行。它有助于保持稳定的条件。
二级结构	多肽或多核苷酸通过3 d结构产生的静电吸引力之间的邻近残留。
印迹	技术用于检测样品中特定DNA序列为样本,采用电泳分离。
转录因子	蛋白质参与转换的过程中,或抄录,DNA转录成RNA。

引用

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修正
文章错误地声明,正极是阴极,这是更新后的2月13日,2023年,正确确定阳极作为正极。