介绍了酶联免疫吸附试验(ELISA测试

有很多实例在生命科学检测和量化的抗原或抗体样品及时和有效的方式是很重要的。在接种疫苗或感染个体识别免疫反应,检测蛋白的表达你想表达细胞表面,执行质量控制测试。有一个工具能够使这样的评估是关键。

酶联免疫吸附试验(ELISA)就是这样的一个测试,证明了宝贵的研究和诊断工具。在本文中,我们将考虑ELISA是什么,它是如何工作的,变化的技术,它可以告诉你什么。

ELISA测试是什么?

ELISA是一种免疫分析常用来衡量抗体或抗原,包括蛋白质或糖蛋白,在生物样品。像其他免疫测定,他们依靠绑定他们的目标,以促进抗体的检测。

通常,ELISA检测执行96 -孔板,使它们适合的格式筛选许多样品。血清,血浆细胞培养上清液,细胞溶解产物,唾液,组织溶解产物和尿都是常见的样本类型用于这些化验,但大多数液体样本类型可用于理论。然而,它是重要的考虑,一些样例类型可能包括抑制因素,如缓冲组件共享相同的抗原决定¹或蛋白酶等因素²可能损害目标或检测组件,可能会干扰测定的性能。

有几种不同的分析格式,但所有依赖绑定目标本身或抗体/抗原能捕捉到目标板的表面。检测步骤包括共轭抗原,或更多的抗体,然后用来启用成功绑定检测和量化,通常由比色检测。

类型的ELISA和ELISA试验图

ELISA最初概念,独立,1971年由伊娃Engvall和彼得·帕尔曼³在瑞典,斯德哥尔摩大学和安东Schuurs Bauke范Weemen⁴在荷兰。他们寻求一种免疫测定方法能够检测抗原或抗体的存在取代未及,雇佣了有潜在危险的放射性标记的抗原或抗体,因此设计了一个enzyme-based选择。

现在有四个主要类型的ELISA,直接、间接、三明治和竞争力。下面的图片(图1)说明抗原的检测;然而,同样的原则适用于抗体检测本质上与抗原和初级抗体的角色逆转。

图1: 类型的ELISA。

直接ELISA试验

与直接ELISA抗原或抗体样本直接吸附到测试板非特异性的方式。共轭检测抗体或抗原特异性的目标然后应用于油井。这后,检测底物用于产生一个可衡量的颜色变化可以量化的一盘读者。

这个试验有几步,更快,提供更少的机会比其他ELISA方法引入的错误。然而,随着非特异性吸附步骤,背景噪音可能会高。没有二次抗体一步意味着没有信号放大,降低检测灵敏度。它还需要结合检测抗体/抗原被创建为每个目标要求。

间接ELISA试验

最初在1978年开发⁵检测人血清白蛋白,间接ELISA,或iELISA,工作在一个非常相似的方式直接ELISA除了添加二级抗体的一步。这使得测试信号的放大,克服的局限性直接ELISA。它还否定,需要有针对性的共轭检测抗体/抗原作为共轭二次抗体只需要物种特有的主要抗体。在总样本抗原绑定到盘子,像直接ELISA、背景噪声仍是一个问题。然而,如果试验用于样品的检测抗体,纯化目标抗原涂布到盘子上,与主抗体来自样例。这大大减少了背景噪音,因此这些化验样本。最受欢迎的确定抗体滴度

间接ELISA的缺点包括延长协议与更多错误的机会和潜在的大二级抗体。

夹心ELISA

1977年开发⁶顾名思义,三明治夹心ELISA抗原抗体之间。技术可以使用直接或间接ELISA格式(夹心ELISA如上图所示是基于间接ELISA)除了而不是非特异性结合的抗原试验板,捕获抗体使得这一个特定的过程。这种组合进一步提高检测灵敏度和特异性。

他们这样做,然而,需要兼容的捕获和检测抗体的测定对功能有效地与大可以是有问题的。这分析通常最步骤,提供更大的错误的机会。由于选择性抗原性质绑定步骤,夹心elisa尤其有用的抗原是在一个复杂的混合抗原纯化不是必需的。

竞争ELISA

竞争ELISA,也被称为一个ELISA抑制或阻断ELISA,可能是最复杂的ELISA技术。最初在1976年开发⁷对于人类choriogonadotropin的检测,检测的工作原理是探测干扰预期输出信号电平,生产成反比关系。更多的目标在示例应用,分析输出信号将会越低。有多种格式,其他可以改编成竞争ELISA类型格式。然而,有两个一般原则;样本的抗原或抗体与绑定到一个有限的参考标记抗体或抗原,分别。另外,样品抗原或抗体可能与一个标签引用绑定到一个有限的抗体或抗原,分别。

竞争ELISA会有一些相同的优势和局限性的格式调整。然而,它是很有用的,当抗原很小,同时限制两种抗体的结合能力,所需夹心ELISA,或者当只有一个抗体是可用的。

ELISA步骤

虽然有差异的协议不同类型的ELISA,有很多阶段的分析应考虑的最常见。

板涂层

大多数elisa的第一步是第一个组件的绑定的化验测试板。这通常是通过被动吸附,这是一个非特异性的过程,那么结果将取决于什么是应用于板。如果antigen-containing示例应用,那么选择性步骤的结果是一个板作为一个整体仍然需要各种各样的抗原结合,不仅那些感兴趣的。然而,如果纯化抗原- - - - - -作为抗体的间接ELISA检测- - - - - -或捕获抗体- - - - - -如夹心ELISA的情况下- - - - - -应用,那么结果是一盘已经选择属性。

多个板类型,其中大部分是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生品,使用不同的绑定属性取决于可用的目标和性质分析。一些目标,包括高度糖基化的蛋白质,碳水化合物,DNA,脂质,短肽和蛋白质的洗涤剂,不吸附。在这些情况下,建议使用盘子已经允许共价键表面而不是治疗。

孵化项目

除了ELISA试剂的盘子后,他们必须允许孵化时间绑定或反应发生。每个孵化的温度和持续时间取决于试验步骤和正在执行的操作。潜伏期为1小时37°C是常用的,比如下面的示例应用程序。然而,像阻塞可能一夜之间执行的步骤一个冰箱和孵化期间检测通常是在室温下进行的时间要短得多。

洗

洗盘子是每个组件的应用程序之间的重要一步的试验直到检测。解决方案从井清空后,井与一个缓冲区洗- - - - - -经常磷酸盐saline-Tween 20 (PBST)- - - - - -删除任何剩余的抗原、抗体或试剂,依然存在。这可能是由手工完成的多通道吸管或使用一个自动档板。未能充分清洗可能导致高背景信号,但是过多的清洗会导致较低的样本信号。不一致的清洗可能会引入跨板不一致,导致不可靠的结果。

阻塞

ELISA板涂层后的蛋白质,阻塞通常是必要的,以防止任何非特异性结合的抗体检测在以下协议步骤(图2)。与试验无关的被添加到混合蛋白质和孵化,占据任何可用的非特异性结合位点。常见的蛋白质阻断缓冲区的选择包括脱脂奶粉,牛血清白蛋白(BSA)和酪蛋白。另外,非离子去污剂,如渐变20或Triton x - 100,可能用作阻断剂但不提供永久阻止像蛋白质。无效的板阻塞会导致增加背景噪音,减少试验敏感性和特异性。

图2: 阻塞过程如何防止非特异性结合。

抗体

实验抗体elisa和它的基石是至关重要的选择正确的,尤其是在使用多个抗体。可以使用单克隆和多克隆抗体,每个都有自己的优点和局限性。单克隆抗体提供高特异性但更昂贵。多克隆抗体另一方面可以绑定一个目标在多个结合位点,放大信号,提高灵敏度。

方法采用二次抗体的使用增加了额外的步骤,延长试验时间,增加错误的机会和需要更多优化找到一双合适的兼容的抗体。然而,敏感性收益多克隆的使用二次抗体可能使这个有价值的或必要的发展一个有效的分析。

检测

无论ELISA类型的使用,都在一个检测步骤中,最常利用enzyme-mediated可见的颜色变化化学测量,然后可以使用紫外可见分光光度法。enzyme-conjugated抗原或抗体应用于试验井,它会绑定目标存在。当一个合适的底物酶添加到板,它会引起颜色变化成正比的目标内绑定。辣根过氧化物酶(合)是一种常用的共轭与衬底3,3’,5、5 ' -tetramethylbenzidine(三甲),然后把蓝色合和黄色的硫酸溶液,停止反应。

吸光度值为每个可以决定使用一个微型板块读者(450 nm的三甲之外后停止解决方案)- - - - - -紫外可见分光光度计的一种- - - - - -和修正计算,平均减法等空白值,平均技术复制或比率的计算标准,按照试验设计。

ELISA工作流的一个例子是图3所示。

图3: 一个iELISA工作流的例子。

ELISA检测结果,积极的ELISA测试告诉你什么?

ELISA结果可能解释定量,定性或方法。在定量分析中,连续稀释的一个已知的标准用于使一代的标准曲线,通常的光学密度(OD)与浓度。,目标的精确数量可以计算未知样品中(图4)。

图4: 标准曲线计算的例子和目标浓度测定未知的ELISA实验。

在定性分析中,数据通常仍将被收集从使用标数值,但结果将被解释为积极或消极的比较空白和/或消极井没有标准曲线。

半定量分析还收集数值数据,而无需使用一个串行稀释或标准曲线。然而,包括正面和负面的标准,通常高和较低的优点,促进水平的相对比较未知样本与已知井之间的地位。使用这些标准监控测定重现性,一套截止值可能与结果阈值决定下面是积极的和消极的。一些化验也可能包括一个“琥珀区”。这个地区的样本值下降,建议重新测试或进一步调查。

而定量分析可能是有利的,一些设置,包含一个完整的标准曲线在每个板占用宝贵的井。因此,存在一个权衡根据信息用户希望获得从化验结果。

像许多化验,结果从一个ELISA很少可能是100%准确的,假阳性和假阴性结果的可能性。因此,大多数测试的相关措施敏感性和特异性;越接近100%,测试就越好。

有许多因素会影响这些值,例如:

• 高背景从非特异性绑定或大
• 可怜的亲和力的抗体为他们的目标
• 试验条件不佳
• 样品状态和复杂性

计算敏感性和特异性的价值观因此许多ELISA检测发展的一个重要步骤,尤其是在诊断设置,以确定如何丰富和可靠的任何结果。

应用ELISA和林ELISA测试

概念以来,这种灵活和廉价的测试已经发现许多使用和继续这样做。下面突出显示其中的一些应用程序。

传染性疾病诊断

ELISA诊断测试的是特别受欢迎的,是可以应用于检测传染性病原体本身和他们诱导的抗体反应主机,根据所选择的试验构象。因此,elisa可以用于识别受感染的个人,可能感染威胁或需要治疗和流行病学监测识别个人的恢复,以前被感染。一些慢性感染,尤其是传染病负载上升和下降,很难检测如果纯粹依赖传染病的检测。然而,持续的抗体反应可能被检测出来⁸在这些人即使微生物本身不能帮助找到这些人。

第一个为人类免疫缺陷病毒(HIV)通用测试,⁹制造于1985年,是一个ELISA检测人血清半胱氨酸蛋白酶抑制物c .许多其它疾病可以在人类和动物使用ELISA诊断,包括登革热、¹⁰乙型肝炎、¹¹SARS-CoV-2,^12,13链球菌等⁸和大肠杆菌。¹⁴

lipoarabinomannan (LAM)开发ELISA检测LAM免疫分枝杆菌细胞壁抗原,在结核病(TB)患者的尿液。鉴于全球患病率和死亡率与结核病和替代结核病诊断的挑战,这是一个急需的检测工具。然而,有批评的敏感性水平¹⁵和临床实用程序。¹⁶然而,最近努力致力于解决这些问题。¹⁷一直在努力扩展测试其他类型的样本,包括痰¹⁸和血清,但不成功。

检测食品过敏原

过敏原¹⁹可能致命,如果摄入受影响的个人,因此它是至关重要的,任何食物宣布脱离某些过敏原,如花生,^20.正是这一点。ELISA为此提供了出色的灵敏度,到ppm (ppm)在某些情况下,和能够应对一些食物类型,如油和牛奶替代方法聚合酶链反应可以与斗争。然而,一些食品加工,如加热可以改变过敏原的构象,可以产生负面影响²¹通过ELISA检测。

生物仿制制药和生物制药测试

随着生物仿制药物的发展,有一个需要证明他们的相似性参考药物试图效仿。这里也elisa发现效用²²在确定因素,如药物浓度和总量检测杂质。

癌症生物标志物的检测

癌症生物标记物²³通常检测血液样本。因此,ELISA检测可以利用作为一种非侵入性的方法来检测和量化已知的生物标志物。

法医药物测试

可以使用elisa毒物学家屏幕法医样本对药物滥用的痕迹²⁴包括安非他命、可卡因、鸦片、美沙酮、苯二氮卓类和大麻类。液体样品时,如尿液、血液更容易,也可以处理固体样品,比如头发,ELISA分析。

怀孕测试

人体绒毛膜促性腺激素(hCG),怀孕的时候分泌的一种激素,²⁵可以通过ELISA检测尿液样本。

自身免疫性疾病

标记表明自身免疫性疾病如类风湿性关节炎等²⁶和红斑狼疮²⁷可能是由ELISA检测和量化。

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