细胞培养基础:设备，基础和协议

对细胞培养不熟悉?那就不要再看了。在这里，您将找到所有细胞培养的基本概述，从建立细胞培养实验室到理解基本原理和基本技术。这是进入细胞生物学世界的一个很好的起点。

什么是细胞培养?

细胞培养是指从动物或植物身上取出细胞，在人工环境中进行培养，用于科学研究。第一个细胞培养技术是在100多年前开发出来的，从那时起，它为科学的巨大突破做出了贡献。今天，它是一个基本工具在世界各地的实验室中用于研究细胞的正常生理和生物化学，发病机制,包括癌症，以及药物有毒化合物。它也用于药物筛选和开发ent大规模生产生物化合物，如疫苗和治疗性蛋白质．^1，2细胞培养在食品工业中的作用也越来越大污染物测试而在细胞农业和非养殖肉生产减轻环境负担。

细胞培养所需的基本设备和试剂

为了进行需要细胞培养工作的研究并执行基本的细胞培养方案，需要几个关键的设备和一些基本试剂，如表1和表2所示。

表1:细胞培养所需的基本设备。^3.，4，5这些图像是用BioRender.com创建的。

附加设备包括层流罩中的吸气泵，以方便地从细胞培养容器中去除介质和试剂;高压灭菌器，用于灭菌设备和可重复使用的玻璃器皿;注射器、针头和镊子;计时器;几个70%乙醇喷雾瓶和纸巾卷用于消毒表面和设备;贴标签用胶带和永久性标记;管架和垃圾桶。 ^{4 ， 5}

表2:细胞培养所需的基本试剂。^2，5

完全培养基		请参阅下面关于细胞介质的部分。
缓冲溶液		磷酸盐缓冲盐水(PBS)用于洗涤细胞。
分离剂		分离酶一种酶，用于将附着细胞从培养容器中分离出来进行培养，如胰蛋白酶
冷冻保存剂		一个代理降低介质的冰点，减缓冷却速度，以减少冰晶形成的风险，从而损害细胞并导致细胞死亡。二甲基亚砜(DMSO)是最常用的。

获得去离子水和蒸馏水以及冰也很重要。要进行的实验的性质将告知需要获得的试剂。

细胞培养实验室设计

任何细胞培养设置都需要几个重要的设计考虑因素。最重要的方面是使用设计来保持无菌和无菌的环境防止细胞被污染．首先，应使用单独的封闭房间或实验室，有一个入口/出口点。在进出实验室时，应在附近放置装有肥皂和消毒液的洗手池，以便进行手洗。专用细胞培养实验服和安全护目镜应存放在实验室入口处。层流罩和培养箱应远离入口，以尽量减少污染风险。同样重要的是，将通风罩和培养箱放置在远离任何空调设备的位置，以防止潜在的污染气流进入无菌的工作环境和培养箱。应该有足够的干净的工作表面，需要定期消毒，并有足够的存储空间，以确保表面保持干净。所有必要的设备和消耗品应在实验室内方便使用，以防止离开和重新进入。符合人体工程学的环境对于层流罩很重要，在工作时要有足够的空间供抽屉或可移动的消耗品手推车使用，同时也要便于使用培养箱、显微镜和其他设备离心机．⁶使用合适的塑料消耗品也很重要尽量减少可提取化合物浸出的风险并污染你的细胞培养物。

细胞培养安全性

细胞培养实验室在处理和操纵细胞和组织以及有毒、腐蚀性或致突变的溶剂和试剂方面存在风险。因此，坚持标准的微生物实践和技术对于降低风险和确保安全至关重要。生物安全防护分为四个等级，分别是生物安全级别(声波测井)。在处理危险生物材料和制剂时，每个级别都有标准的微生物实践、安全设备和设施保障措施。BSL-1是大多数研究和临床实验室共同使用的基本防护级别，其中使用的药剂已知不会对正常健康人类造成疾病。BSL-2适用于已知通过摄入或经皮或粘膜暴露导致不同严重程度人类疾病的中等风险制剂。大多数细胞培养实验室应至少达到BSL-2，但具体要求取决于所使用的生物材料和所进行的工作类型。BSL-3是对造成严重和潜在致命感染的病原体的要求，而BSL-4是最高的控制水平，是对处理具有高度个体威胁生命疾病风险的传染性病原体的实验室的要求。^4，7

以下是细胞培养实验室的基本安全建议。该清单绝不是完整的，应补充适当的生物安全水平建议。

-始终穿戴适当的个人防护装备，包括实验室工作服、手套和安全护目镜。
-始终阅读材料安全数据表(MSDS)，以确保在处理任何物质时采取适当的安全预防措施。
-在实验前后对所有工作台面进行消毒。
-定期清洁实验室设备，即使它没有被污染。
-避免产生气溶胶和/或飞溅物。
-在接触潜在危险物质后和离开实验室前洗手。
-在处置前对所有可能感染的材料进行消毒。
-向相关人员(如实验室主管、安全员)报告任何可能导致接触感染性材料的事故。
-不要在实验室吃、喝、吸烟、拿隐形眼镜、涂化妆品或储存供人食用的食品。

细胞培养基础

培养条件

为了细胞的生存和增殖，培养环境尽可能地复制细胞的生理环境是至关重要的。可以控制的培养条件包括温度、相对湿度和CO₂水平以及与培养基有关的因素，如营养成分、pH值、渗透压和补充量和频率。这些变量会随着时间的推移而波动，所以它们应该是波动的监控．表3突出了大多数哺乳动物细胞培养的最佳培养条件，但也存在例外。⁵

表3:大多数哺乳动物细胞的最佳细胞培养条件。^{1，2，4，8}

pH值		7.0 - -7.4
渗透性		280 - 320 mOsmol /公斤
有限公司2		5 - 10%
温度		35-37◦C

原代细胞vs永生细胞

原代细胞培养是直接从完整或分离的组织或器官碎片中分离出来并在培养皿中培养的细胞。一旦原代培养物第一次被传代培养，它就被称为细胞系。原代细胞系具有有限的寿命，在达到衰老状态(细胞分裂停止)之前只能传代10-20次。¹

有些细胞系没有寿命限制，有无限增殖能力。这些细胞系被称为连续或永生的细胞系．细胞的永生化可以通过多种方式发生。癌细胞具有固有的突变，使细胞在培养中无限制地繁殖。最初寿命有限的正常细胞可以通过促进生长基因的突变而变成永生细胞。在培养物中生长的正常细胞也可以通过化学治疗或引入激活促生长基因的致瘤病毒而有意地永生。图1显示了原代到转化连续细胞系的演变过程以及每个阶段的理论细胞产量。⁹

图1: 原代细胞系到连续细胞系的进化和理论细胞产量。

贴壁培养vs悬浮培养

贴壁细胞在细胞培养容器表面呈单层生长。当通过时，需要使用一种脱离剂将它们从表面分离。它们在电镀后的几个小时内重新附着在表面上。悬浮细胞在细胞培养容器表面不形成单层，而是保持悬浮状态。细胞形成团块，特别是在高密度时。^1，10

哺乳动物vs非哺乳动物培养

哺乳动物细胞培养是最常见的，然而，来自大量生物体的细胞也可以培养，比如植物、昆虫、细菌和酵母。植物细胞培养物通常在液体培养基中作为细胞悬浮培养物或在固体培养基上作为愈伤组织培养物生长。细胞来源于黑腹果蝇或粘虫Spodoptera frugiperda是分别用于生物化学测定或重组蛋白表达的昆虫细胞系的例子。对于细菌和酵母来说，少量细胞通常生长在含有营养物质的固体载体上，通常是琼脂之类的凝胶，而大规模培养则是将细胞悬浮在营养肉汤中。

细胞生长和融合

细胞培养生长一般分为四个阶段(图2)。滞后期是细胞适应培养条件，不分裂的时期。当细胞活跃分裂时发生对数期。这是细胞实验和数据收集的最佳阶段。当细胞达到log期晚期时，应进行传代培养。这发生在拥挤之前。当细胞过度拥挤时，细胞生长减慢。这被称为平稳期或平台期。这个阶段的细胞处于细胞应激的危险中。当细胞死亡的自然过程占主导地位时，细胞群体被认为处于死亡阶段，也称为衰退阶段。当绘制细胞计数随时间的日志时，它会生成如图2所示的s形曲线。 It is important to note that the amount of time spent in each phase differs between individual cell lines and cultures.¹¹

图2: 细胞生长的四个阶段。

描述单层细胞培养的一个重要指标是融合度。它是在显微镜下观察到的被一层细胞覆盖的培养容器表面积的百分比。例如，当一个培养容器的一半表面积被细胞覆盖时，这个群体被认为是在50%的汇合。图3中的示意图显示了不同单元格汇合的示例。细胞密度用于描述悬浮生长的细胞。^2，5

图3: 图示:显微镜下细胞在20%、50%、80%和100%合流条件下的4个视野。这个图像是用BioRender.com创建的。

选择细胞系

在世界各地的实验室中，有数千种已建立的细胞系，可以从商业或非营利供应商(细胞库)处购买。从信誉良好的供应商那里获得细胞系是至关重要的，因为细胞是经过验证和无污染的。从其他实验室获得细胞系有很高的污染风险和缺乏细胞系验证，因此建议不要这样做。

时，应考虑表4中的标准选择合适的细胞系做个实验。所选择的细胞系在很大程度上取决于要进行的实验的性质和要求。

表4:选择细胞系时要考虑的标准。^1，2

物种		是否需要使用特定物种的细胞系?如果没有，非人类和非灵长类细胞系通常需要较少的生物安全限制，这可能是有利的。
功能特征		使用合适的细胞系进行实验。例如，肝和肾来源的细胞系可能更适合毒性测试。
有限的或不朽的		有限细胞系在功能上更相关，因为它们没有经历永生化，然而永生化细胞系通常更容易维持和克隆。
正常的还是变换的		转化后的细胞系生长速度加快，电镀效率提高，这是有利的，但细胞发生了永久性的遗传变化。这是否会影响你的实验?
生长条件及特点		生长速率、克隆效率或饱和密度对你的实验重要吗?你需要细胞贴壁还是悬浮?例如，如果你想高产地表达重组蛋白，你会选择一种可以在悬浮中生长的快速生长的细胞系。

表5列出了20种常用细胞系及其种类、组织起源和形态特征。细胞的形态通常被描述为成纤维细胞、上皮细胞或淋巴细胞，这表明细胞的起源和物理外观。成纤维细胞呈双极或多极，呈细长状;上皮细胞呈多角形，通常具有更规则的尺寸;淋巴母细胞呈球形，通常在悬浮中生长。^1，5

表5:20种常用细胞系及其特性。

细胞系	起源	物种	形态	文化类型
海拉	子宫颈	人类	上皮	附着
hek - 293	胚胎肾 转化与 腺病毒	人类	上皮	附着
Jurkat	外周血	人类	淋巴母细胞	悬架
HL-60	人类早幼粒细胞 白血病细胞	人类	Lymphoblast-like	悬架
MCF-7	乳腺癌	人类	Epithelial-like	附着
Saos-2	骨	人类	上皮	附着
曲泽	前列腺癌	人类	上皮	附着物，可适应悬浮
a - 549	肺癌	人类	Epithelial-like	附着
消息灵通的G2	肝癌	人类	Epithelial-like	附着
SH-SY5Y	骨髓	人类	上皮	附着或悬浮
H-9	胚胎干细胞	人类	淋巴母细胞	悬架
CHOs(如CHO-K1)	卵巢的中国	仓鼠	上皮	附着
维罗	肾上皮细胞	非洲绿猴	上皮	附着
COS-7	肾细胞	非洲绿猴	纤维母细胞	附着
NIH / 3 t3	纤维母细胞	鼠标	纤维母细胞	附着
BHK-21	纤维母细胞	叙利亚仓鼠	纤维母细胞	附着
MDCK	上皮细胞	狗	上皮	附着
16种	成肌细胞	老鼠	成肌细胞	附着
ZF4	胚胎成纤维细胞 细胞	斑马鱼	纤维母细胞	附着
Sf9	卵巢	秋粘虫(Spodoptera frugiperda）	上皮	悬浮物或附着物

细胞系认证

细胞培养是世界各地实验室的重要工具。然而，细胞系可能被错误识别或被其他细胞污染。这使已发表的数据无效，浪费了实验室的时间和资源。由于这一问题的严重性以及确保结果有效和可重复的需要，期刊、机构和资助机构现在建议或要求细胞系认证．细胞系鉴定可以通过使用多态短串联重复(STR)位点的遗传谱来实现。细胞应在收到新细胞系后进行鉴定，并在继代培养期间定期进行鉴定。¹²

细胞培养基:为你的细胞选择合适的培养基

培养的细胞用液体媒体．在为细胞配制培养基时，有四个关键成分需要考虑，详见表6。细胞介质要求的具体细节可以在数据表中找到。在培养新细胞系时，请务必检查数据表中有关培养条件的详细信息。

表6:哺乳动物细胞培养基的关键成分。^1，13，14

基础培养基		基础培养基是营养物和盐的混合物。有不同的公式，其中包括最低必需培养基(MEM)， Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和Roswell Park Memorial Institute (RPMI)。它们可以从商业来源购买液体形式或粉末形式。
谷氨酰胺		谷氨酰胺是细胞生长所必需的一种氨基酸。基础培养基可以购买谷氨酰胺，不含谷氨酰胺，或稳定的二肽谷氨酰胺替代品。确保你的培养物在正常生长条件下含有谷氨酰胺是很重要的。
动物血清		细胞通常在补充了动物血清的基础培养基中生长。这就是所谓的“完全”介质。血清为细胞提供所需的生长因子和营养。胎牛血清是最常用的。在大多数情况下，添加血清使完全培养基混合物的最终体积在5%至20%之间。
抗生素		细胞培养基中经常添加青霉素和链霉素的抗生素组合，作为防止细菌生长的措施。使用无菌技术，可以在不使用抗生素的情况下培养健康的细胞。

标准细胞培养方案

有几个基本的细胞培养方案，在所有的细胞培养实验室执行。熟悉和理解这些协议是很重要的。

无菌技术

无菌技术，如果持续进行，可以帮助确保所有培养基和培养容器的无菌性，从而减少细胞暴露于污染物保持培养物的健康、活力和纯净。严格的无菌技术是成功培养细胞的必要前提，使培养物免受这两种细菌的侵害微生物污染和细胞交叉污染．无菌技术包括操作、试剂和工作场所，总结见表7。^15，16

表7：细胞培养时所需无菌技术的总结。

处理	试剂/媒体	工作场所
·温柔小心的操作。 ·启动前对所有物品进行灭菌。 ·无菌移液器，移液头和塑料制品。 ·禁止将无菌物品接触未消毒的表面(包括戴手套的手接触自己的皮肤、衣服或头发)。	·所有试剂和设备的预灭菌。 ·试剂中没有可见的污染。 ·aliquote试剂到较小的体积，以防止整个库存的污染。 ·拥有自己的工作库存可以消除来自共享库存的污染风险。	·检查培养罩是否正常工作。 ·工作区域始终保持无菌和整洁。 ·经常清洁和净化通风柜、恒温箱和冰箱。

原代细胞分离

原代细胞分离可用于多种复杂的生物样品，包括组织(皮肤、肝脏、肿瘤、脑、肺等)、骨髓、血液、脾脏和淋巴结。有许多不同的方法来制备样品，以获得最佳的细胞分离。您选择的方法取决于您的起始样品，可能涉及从样品中去除某些元素或简单地创建单细胞悬浮液。当从完整组织中分离细胞时，必须首先使用机械力和/或蛋白水解酶破坏将细胞结合在一起的细胞外基质(表8)。 ¹⁷

原代细胞分离的基本轮廓要求将分离的组织片切碎或用无菌剪刀或手术刀切成2-4毫米的片。将组织片加入适当的缓冲液或平衡的冰盐溶液中，清洗2-3次。根据方案加入解离酶并孵育。通过轻轻移液使细胞分散。细胞悬浮液通过细网过滤并洗涤2-3次。细胞在培养基中重悬并播种。¹⁸

表8:用于细胞分离的组织分离方案中常用的酶。¹⁸

胶原酶		水解胶原蛋白，广泛用于从动物组织中分离细胞。
透明质酸酶		与胶原酶结合使用，催化1,4-β- d -糖苷键的水解。
DNase		添加到细胞悬浮液中，以减少因受损细胞释放DNA而导致的细胞结块。
弹性蛋白酶		用于消化含有大量弹性蛋白的组织。
胰蛋白酶		一种丝氨酸蛋白酶，具有肽键的特异性，通常与其他酶(如弹性酶和/或胶原酶)结合用于组织解离。

接种/使细胞

继代或传代是指稀释已达到高度合流的细胞，使其能够连续培养繁殖。贴壁细胞在80-90%融合时传代，悬浮培养在细胞开始结块和混浊时传代。记录每个细胞系的细胞传代数是很重要的。这有助于在原代细胞达到衰老之前监测其生存能力和计划实验。它有助于监测永生化细胞的年龄，因为传代数越高，遗传漂变越远。实验不应在细胞系上进行 非常高的通过次数 ． ⁴

重要的是，在任何时候都要轻柔地处理细胞，因为剧烈或粗暴的处理可能导致细胞损伤或死亡。永远不要将培养基或洗涤缓冲液直接移到细胞上，总是轻轻地将其添加到容器的一侧，以避免伤害细胞。当重新悬浮颗粒或搅拌混合细胞时，要轻轻进行。

简单地说，贴壁细胞的传代培养方案如下:去除培养基，用PBS清洗一次细胞。添加一种分离剂，如胰蛋白酶(分解使细胞粘附在血管上的蛋白质)，并在37°C下培养细胞，直到它们完全分离。分离时间从1-20分钟不等，取决于细胞系。在显微镜下观察细胞以确定何时发生脱离。通过向细胞中加入完整的培养基(血清中含有蛋白酶抑制剂，使胰蛋白酶失活)并在a中旋转使胰蛋白酶失活离心机(3-5分钟，150-300 x g)到颗粒细胞。去除培养基(颗粒顶部的液体)，轻轻将细胞重悬在新鲜培养基中，并将细胞置于新的培养容器中，达到所需的密度。对于悬浮细胞，不需要胰蛋白酶。收集细胞并离心(在150-300 x g下离心3-5分钟)形成球团，去除培养基，将细胞重悬在PBS中进行洗涤步骤。在另一轮离心后取出缓冲液，将细胞重悬在新鲜培养基中，并按所需密度进行复制。⁵

低温保存和解冻

细胞系是宝贵的资源，因此长期保存是至关重要的。低温贮藏指在极低温度下冷却和储存细胞以保持其活力的过程。电池适合在-130°C以下的温度下长期储存。

最好的方法冷冻保存培养细胞是将它们储存在液态氮中，在有冷冻保护剂(如DMSO)存在的完全介质中。防冷冻的代理降低介质的冰点，也允许一个较慢的冷却速度，大大降低冰晶形成的风险，可以破坏细胞和导致细胞死亡。细胞应以高浓度(如90%汇合)和尽可能早的传代数低温保存。简而言之，低温保存包括细胞洗涤和成球，用DMSO(例如，5% DMSO)在完全培养基中重悬，并将细胞悬浮液转移到1ml无菌低温瓶中。由于细胞必须缓慢冷冻，因此将冷冻瓶放置在控制速率的冷冻冷冻机或冷冻容器中。冷冻容器在-50 ~ -80℃下储存24小时，然后将冷冻瓶转移到液氮储存中。^2，8

确切的冷冻条件取决于所使用的细胞系。检查细胞系特定条件是非常重要的，否则你的冷冻库存在解冻和重新培养时可能无法产生活细胞。

来恢复细胞系从液氮储存，冷冻小瓶在便携式液氮容器或干冰运输到细胞培养区。冷冻瓶中的DMSO一旦解冻就会对细胞产生毒性，因此为了确保细胞的高存活率，细胞必须在37°C的水浴中快速解冻，并立即转移到带有预热培养基的培养皿中。介质会稀释二甲基亚砜，使其不再处于有毒浓度。一旦解冻的细胞繁殖并传代两次，它们就可以用于实验。最好的做法是尽快冷冻更多的细胞，并更换从长期储存中取出的小瓶。²

检测细胞是否有支原体感染

细胞培养的一个主要问题是支原体感染．这种细菌感染可以改变细胞的行为和代谢，对细胞产生不良影响。定期进行支原体检测是非常重要的，特别是对于连续的细胞系。良好的做法是在收到新细胞系时检测支原体，在冷冻前解冻培养，每隔4天检测一次- - - - - -细胞库培养6周。检测支原体的一种简单可靠的方法是用Hoechst 33258(一种与DNA特异性结合的荧光染料)对细胞样本进行染色，并在荧光显微镜下观察。无支原体细胞显示清晰干净的细胞核Hoechst染色，而感染支原体的细胞在细胞核外也显示丝状染色模式，即细菌DNA(图4)。^5，19，20.

图4: 未染色细胞(上)和用Hoechst 33258染色的未染支原体(左下)和染支原体(右下)的细胞的示意图。未污染细胞染色为细胞核，污染细胞染色为细胞核和细胞质染色。细胞质染色显示存在支原体细菌DNA。 ⁵ 这个图像是用BioRender.com创建的。

细胞计数

尽管最近自动细胞计数器的发展，手工细胞计数使用血细胞计仍然是最常用的方法。血细胞计由厚的玻璃显微镜载玻片组成，载玻片上有两个蚀刻的垂直线网格，形成腔室。还提供了一个薄的覆盖玻璃。使用前务必清洁血细胞计和盖玻璃，并将盖玻璃置于室上。加10- - - - - -将20 μl的细胞悬浮液倒入显微镜载玻片上的两个腔中，其中一个置于盖玻片下。使用倒置相衬显微镜在20倍的放大，以计数细胞在每四个外正方形如图5所示。你应该以数到100为目标- - - - - -每平方200个单元格以获得准确的结果。如果你的细胞太少，那么下次用更少的培养基重悬你的细胞。如果你有太多的细胞计数，然后重悬你的细胞在更大体积的培养基。数完每个角后，把数加起来，除以4。你的细胞浓度就是你的计数乘以10⁴细胞/毫升。计算细胞总数，用浓度乘以细胞悬浮液体积。例如，5ml浓度为80 × 10的细胞悬液⁴细胞/mL共为400 × 10⁴单元格或4 × 10⁶细胞或四百万个细胞。^{4，5，21，22}

图5: 用血细胞计计数细胞。上图为血细胞计的俯视图和侧视图示意图。左下角的面板显示了显微镜下计数室的样子。红框突出显示要计数的象限。右下角的面板是一个如何对象限内的单元进行计数的示例。

细胞转染

细胞转染是指将核酸(DNA或RNA)传递到培养的细胞中。最常用的试剂是阳离子脂质，它可以与核酸结合形成带正电的复合物，并允许DNA/RNA与带负电的细胞膜相互作用。这导致核酸通过内吞作用有效地进入细胞。这通常被称为脂质感染或脂质转染。另外，核酸也可以通过电穿孔、DNA与磷酸钙共沉淀或聚苯乙烯/DMSO冲击的方式传递到细胞中。传递的DNA通常不会整合到宿主基因组中，因此是短暂的。为了实现基因的稳定表达或敲除，可以设计稳定的细胞系。这需要DNA载体的设计和抗生素的选择，其中DNA已经稳定地整合到基因组中。^23，24

脂肪转染方案非常简单。本质上，制备了含有转染所需的合适浓度的DNA/RNA的溶液，并制备了含有脂肪转染试剂的溶液。将两种溶液混合在一起，并根据方案孵育一段时间。然后将溶液加到60- - - - - -转染后6小时即可进行80%的融合细胞和实验。瞬时转染通常持续72小时。²⁵

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