COVID-19让质谱分析成为焦点

COVID-19大流行使病毒学和疫苗开发领域成为人们关注的焦点。随着全球科学界竞相寻找针对SARS-CoV-2病毒的药物和候选疫苗，它依赖于能够快速解决病毒结构以及它如何与人类宿主细胞蛋白质相互作用的工具。这些技术已成为我们对抗当前和未来传染病的一个重要组成部分。

病毒学家的结构生物学工具包的一个重要补充是使用先进的质谱(MS)，这是与冷冻电子显微镜(cryo-EM)一起用于研究SARS-CoV-2的宝贵资产。质谱方法可用于研究蛋白质在个体水平和更大的复合物。在单个蛋白质水平上，MS可以揭示蛋白质结构和配体相互作用，并表征翻译后修饰(PTMs)。对于大的蛋白质复合物，MS可以揭示蛋白质化学计量学的见解，并确定涉及蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)的界面。

研究病毒需要整合几种互补的质谱技术。在本文中，我们回顾了一系列可以解决有关病毒结构和功能问题的方法。

揭示病毒蛋白的结构和功能

MS的进步意味着现在有了更广泛的方法来研究病毒结构。例如，自下而上蛋白质组学(包括在质谱分析之前对蛋白质进行蛋白质水解消化)与肽测序相结合，可以提供关于初级蛋白质结构的信息，并可以确定大型复合体中单个蛋白质或多个蛋白质的身份。或者，单个蛋白质上的有限蛋白水解偶联到质谱(包括在质谱分析之前消化含有少量蛋白酶的蛋白质)可以提供单个蛋白质的高阶结构及其折叠状态的见解。这两种方法都是识别宿主细胞内病毒蛋白的强大工具，并在病毒生命周期中了解它们的不同结构和构象。

另一个了解蛋白质结构和功能的流行质谱工具是氢氘交换质谱(HDX-MS)。该方法测量了蛋白质骨架中氢与周围溶剂之间的同位素交换速率，提供了关于单个蛋白质或PPIs的结构和构象变化的信息，以及对蛋白质-配体相互作用位点的深入了解。

HDX-MS最近用于评估前瞻性治疗性抗体对的结合，这些抗体对可以同时中和SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域(RBD)。¹这项技术成功地使研究人员能够根据抗体的RBD结合模式对其进行分组。这很重要，因为我们的目标是找到能够在不同位点结合的抗体，并成为治疗性抗体鸡尾酒的理想搭档。

这些质谱方法都提供了病毒蛋白质的基本结构信息。在下一节中，我们将看看MS如何被用于揭示这些蛋白质的进一步见解，以了解它们作为治疗靶点的潜力。


图1:SARS-CoV-2结构图像，显示了讨论的关键蛋白质。资料来源:赛默飞世尔科学公司。

检查糖蛋白峰值

糖基化是真核细胞蛋白质中研究最多的PTM之一，因为糖基化涉及大量的生理功能。糖蛋白也是人类致病病毒的主要成分之一，在病毒与宿主细胞的相互作用中起着关键作用。它们在宿主细胞进入中的功能使它们成为抗病毒药物和疫苗的理想靶点。因此，了解病毒蛋白质上的位点特异性糖基化模式是至关重要的。质谱可以用于大规模蛋白质组学水平上研究糖基化位点，并检测单个病毒上的独特糖蛋白。

像其他冠状病毒一样，SARS-CoV-2的病毒包膜由三种蛋白质组成:膜蛋白、包膜蛋白和刺突蛋白。刺突蛋白高度糖基化，在穿透宿主细胞和引发感染方面起着至关重要的作用，使其成为疫苗的主要目标。一些研究使用了质谱方法，揭示了关于SARS-CoV-2糖蛋白的基本信息，这些糖蛋白是我们今天拥有的COVID-19疫苗的基础。

在其中一项研究中，²研究人员使用纳米液相色谱-质谱联用技术(纳米lc - ms)分析了纯化的重组SARS-CoV-2刺突蛋白的位点特异性糖基化。糖肤是分析了通过纳米lc - ms测定了刺突蛋白的所有22个n -链聚糖位点的聚糖组成。研究人员将其与低温电镜结构结合起来，揭示了n链聚糖如何保护SARS-CoV-2尖刺表面的某些区域。这种屏蔽是病毒糖蛋白的特征，包括艾滋病毒和流感病毒的糖蛋白，确定哪些区域受到保护有助于突出病毒结构中最保守和潜在脆弱的区域。

在另一项研究中，^3.研究人员使用质谱方法描述了SARS-CoV-2刺突蛋白上聚糖的位点特异性差异，并确定这些差异如何影响刺突与人类ACE2之间的相互作用。将不同的蛋白水解策略与先进的质谱技术相结合，揭示了22个已知糖基化位点上聚糖之间的微观异质性。然后，可以将这些信息映射到SARS-CoV-2刺突蛋白与其目标ACE2蛋白复合物的3D结构模型上，以帮助预测当前SARS-CoV-2病毒蛋白和新出现的新变体蛋白的表位可及性和免疫原性。

这些研究表明，结合来自质谱分析的详细化学信息和来自冷冻电镜的互补3D图像，可以提供病毒糖蛋白结构和功能的深入描述。

描述病毒的分子机制

除了帮助病毒进入人类细胞的糖蛋白峰值外，病毒还在进入宿主细胞后编码关键的细胞机制，使它们能够复制、组装新的病毒颗粒并感染更多的细胞。对这些蛋白质的研究对于了解病毒的生命周期和评估它们作为抗病毒治疗和疫苗靶点的潜力都很重要。

传统上，研究这些蛋白质的生理构象和与结合伙伴的复合物一直具有挑战性。但是，质谱技术的进步已经导致采用原生质谱来研究天然状态下的完整蛋白质复合物，从而更准确地了解生理条件下的结构和功能。⁴这种方法已被用于表征SARS-CoV-2分子机制的两个重要组成部分——核衣壳蛋白⁵和主要蛋白酶。⁶

SARS-CoV-2核衣壳蛋白是病毒最具免疫原性的结构蛋白，参与了病毒生命周期的几个阶段——从结合和保护病毒基因组到增强其转录。使用天然质谱，研究人员已经能够非常详细地描述全长核衣壳蛋白的RNA结合特性，包括使用康复的COVID-19患者的恢复期血浆，哪种形式的核衣壳蛋白产生了最高的抗体反应。⁵通过使用天然质谱，他们可以确定蛋白质在不同条件下结合RNA时的二聚体或单体的组装状态。

在SARS-CoV-2中，主要蛋白酶(Mpro)在处理由RNA翻译的病毒蛋白中起着关键作用。一个团队使用原生MS来表征主要蛋白酶的功能单元，并确定二聚体与单体形式的平衡，揭示了对二聚体的强烈偏好，并提供了结合亲和力的见解。⁶这些数据可以用于后续Mpro抑制剂的筛选，为药物开发提供一个起点。

在抗病毒药物的设计中，这些蛋白质是非常理想的目标，以尽可能接近地反映其生理环境的形式了解它们的功能是很重要的。这些例子显示了原生MS在快速提供蛋白质高级结构和自然动态和行为的详细见解方面的强大功能。

图2:整合结构生物学原理图。资料来源:赛默飞世尔科学公司。

揭示病毒和宿主蛋白质之间的相互作用

病毒依赖于它们与宿主细胞蛋白质相互作用的能力。有效地，MS技术的主要优势之一是可以表征PPIs的方法范围。

例如，耦合到质谱的有限蛋白质水解是一种简单而快速的方法来确定相互作用的确切蛋白质残基:如果一个蛋白质与另一个蛋白质结合，它将使蛋白酶位点无法访问，提供关于界面位置的信息。

另一种方法是亲和纯化质谱(AP-MS)，它利用分子之间特定的结合相互作用，在亲和富集步骤中分离感兴趣的蛋白质。通过将亲和纯化与定量质谱相结合，可以在不同条件下对PPIs进行研究。这也可以扩展到研究ptm如何促进PPIs。AP-MS在一项药物再利用研究中效果显著，⁷研究人员在人类细胞中表达了26种标记的SARS-CoV-2蛋白，然后确定了与它们有物理关联的蛋白质。通过这种方法，他们确定了332种PPIs，其中66种是可药物的，29种是已批准药物的靶标。这迅速使研究小组能够突出许多针对SARS-CoV-2的潜在候选药物。

研究病毒和人类蛋白质相互作用的另一种方法是交联质谱(XL-MS)。在这种方法中，可溶性交联剂或可光激活的氨基酸被用来交联邻近的残基。⁸然后这些交联蛋白被消化成多肽，并用串联质谱分析;这些数据可以与其他可用的结构信息相结合，以模拟蛋白质复合物的形状。

一个研究小组使用基于紫外线的XL-MS方法绘制了SARS-CoV-2 RNA与人类宿主细胞蛋白质之间的相互作用。⁹他们使用RNA反义纯化结合质谱，可以快速识别特定RNA分子的蛋白质相互作用伙伴。这使得在一次实验中就能表征整个sars - cov -2人类细胞相互作用组，并确定了104种具有潜在治疗重要性的蛋白质。

结论

了解病毒宿主PPIs的结构、时间和空间复杂性对于开发针对现有病毒病原体的新疗法和疫苗，以及保护我们免受可能导致未来大流行的新出现病毒的侵害至关重要。今天，存在一系列结构生物学工具，以更好地了解病毒蛋白的结构、功能和动力学。该工具包的核心是MS技术的创新，为冷冻电镜、x射线晶体学和诱变等传统结构生物学技术提供了一系列补充方法。COVID-19大流行期间的开创性研究表明，作为病毒学和疫苗学综合结构生物学工具包的一部分，MS可以发挥强大的作用。

引用:

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