CRISPR基因疗法:使用ddPCR评估基因编辑的成功

β地中海贫血是世界上最常见的常染色体隐性疾病之一，研究人员正在寻求一种基因疗法来治疗这种疾病。科学家们正在应用各种策略和技术来纠正由此引起的潜在基因失衡β-地中海贫血，包括使用CRISPR来纠正突变基因。这种方法很有前景，但科学家们仍在努力提高CRISPR的编辑效率，这仍然是一个悬而未决的问题。因此，CRISPR成功纠正突变的能力与β-地中海贫血仍不确定。因此，研究人员需要将CRISPR编辑协议与水滴数字PCR (ddPCR)等质量控制工具配对，以准确检测成功的CRISPR编辑的存在。

一种有前途但复杂的基因编辑方法

约占全球人口的1.5%携带与β地中海贫血，每年有6万多例新确诊病例。不幸的是，科学家们还没有一个直接的方法来解决基因层面上的这种情况。成人血红蛋白由两对球蛋白亚基组成，α球蛋白和β血红蛋白必须以相等的数量表达，血红蛋白才能正常发育。的人β地中海贫血的基因中含有基因突变β球蛋白,HBB，这导致了对的基因．免费的α-球蛋白，然后形成有毒沉淀物，损害红细胞发育，杀死成熟的红细胞。因此，患者会出现各种严重的症状，并经常导致过早死亡。

一些研究表明，删除α球蛋白基因,HBA，可能会改善结果。介绍一个健康的HBB基因通过慢病毒载体改善患者的临床结果，但前提是这些患者已经表达了一些β球蛋白。一个研究小组最近在法国和意大利结合这两种方法:他们使用CRISPR进行删除HBA并将其替换为HBB希望能恢复两种血红蛋白亚基之间的平衡。

执行这样的编辑是一项复杂的任务。首先，在设计出定位需要编辑基因的引导RNA (gRNA)后，科学家需要使用病毒载体将其引入细胞。然后，gRNA必须确定正确的切割部位侧翼HBA基因，而Cas9必须执行切割。相同的gRNA必须便于插入HBB基因在同一位点。如果CRISPR不能成功移除，这种双重编辑方法将不起作用HBA并介绍HBB吉恩在同一个地方。这样一个多方面的编辑需要严格的质量控制，以确保CRISPR在正确的位置执行正确的编辑。这就是ddPCR技术的用武之地。

ddPCR检测的优点

ddPCR是一种高灵敏度的工具，旨在检测和量化罕见的遗传变异，它可以用于检测CRISPR编辑的结果。例如,ddPCR检测可以检测CRISPR编辑通过同源定向修复(HDR)和非同源端连接(NHEJ)。它可以还可以检测切除和倒置与序列长度无关。

ddPCR技术的工作原理是将样本分成大约2万个nl大小的液滴，并在每个液滴中进行单独的PCR反应。每个液滴含有一条或几条核酸链。如果一个液滴含有具有目标基因序列的链，DNA就会放大，液滴就会释放出强烈的荧光信号。如果液滴不包含目标序列，液滴只会发出微弱的荧光。通过计数强荧光和弱荧光液滴，可以非常灵敏地检测特定序列，并非常准确地测量原始样品中目标序列的浓度。

与下一代测序相比，ddPCR是快速，廉价，不需要劳动密集型，并且可以检测罕见事件而不受读取深度的限制。ddPCR也比较多灵敏准确而不是定量PCR (qPCR)。虽然研究人员必须使用标准曲线来解释qPCR结果，将数据暴露在扩增偏倚中，但ddPCR直接量化遗传变异，而不需要标准曲线，因此提供了绝对计数。

上述欧洲小组开发了双重编辑方法来治疗β-地中海贫血使用ddPCR检测来评估他们编辑的成功。研究人员首先使用ddPCR技术进行量化HBA拷贝数，与β地中海贫血症状。他们还用它来检测成功的插入HBB．在人脐带血来源的红系祖细胞(HUDEP-2)中，研究小组显示了稳健的插入HBB基因;研究小组证实，每个细胞有0.8份基因的靶向整合。

该团队无法使用qPCR检测到这种整合。由于qPCR结果测量方法的内在可变性，该技术无法检测每个细胞中低于2或3个基因拷贝的浓度。如果没有ddPCR，这些研究人员就无法证明他们的CRISPR策略在未来的临床测试中具有潜力。

未来的CRISPR应用

约30项临床试验正在计划或进行中研究CRISPR是否可以用于治疗遗传疾病，监管机构可能会在不到十年的时间内批准首个基于CRISPR的基因疗法。但鉴于开发可靠的CRISPR编辑协议的持续挑战，开发CRISPR疗法的生物制药公司必须格外小心，以确保他们的疗法是安全有效的。ddPCR技术可以提供他们所需要的信心。

例如，ddPCR检测可以通过使用跨越原生基因组和供体序列交界处的探针来检测任何CRISPR编辑。研究人员和生物制造商可以通过分析特定CRISPR编辑的细胞系，在它们到达患者之前就筛选出包含不成功编辑的细胞系。反过来，这将增加基于crispr的基因疗法临床成功的机会，并为新一代治疗难以治疗的遗传疾病打开大门β地中海贫血。