电子显微镜技术、优势、局限性和应用程序

电子显微镜是什么?

在回答这个问题之前,我们需要在历史和退一步承认荷兰科学家的工作安东尼·范·列文虎克(1632 - 1723),英国人罗伯特胡克(1635 - 1703)。既发挥了辅助性作用的识别微生物使用玻璃镜片和发射领域的光学显微镜和微生物学。然而随着领域的进步,德国物理学家恩斯特阿贝认识到,光学显微镜将受限于光学物理的基本定律——光的衍射限制光学显微镜的分辨率。这被称为“阿贝衍射极限”。¹阿贝推断显微镜无法解决两个物体位于小于λ/ 2 NA,λ是光的波长和NA的数值孔径成像镜头。这个方程定义的中心波长分辨率限制,λ。它实现分辨率正比,波长越短,分辨率越好。这是链接到电子显微镜。

没有德国物理学家的工作汉斯·布希(1884 - 1973),电子显微镜的发展是不可能的。他是第一个表明磁场可以集中一束电子的方式类似于玻璃镜片可以专注可见光。的德国物理学家恩斯特Ruska(1906 - 1988)注意工作的布施和应用电子显微镜的发展,他赢得了1986年诺贝尔物理学奖。²他也清楚的意识到他的发现可以如果电子的波长可以减少。法国物理学家路易德布罗意(1892 - 1987)已经照顾使用波粒二象性的理论表明,电子束作为波的波长,可以预测基于电子的速度。这可能是通过加速调整电子通过一个电势(实际上这是称为电子显微镜的加速电压)。电子波长在不同电压加速表1中给出。

表1:电子波长在不同电子加速电压(电压越高,更高的电子的速度)。

加速电压(kV)	波长(pm)
1	38.8
10	12。2
20.	8.6
30.	7.0
40	6.0
60	4.9
80年	4.2
One hundred.	3所示。7
120年	3所示。4
200年	2.5

现在很清楚的是对显微镜分辨率的影响。表中列出的电子的波长大约是5数量级低于最低的波长的可见光(380000点)。根据上面给出的阿贝衍射极限方程,这将有一个巨大的空间分辨率的影响。这是理论发展的驱动力电镜。

毕竟,我们可以回答我们最初的问题。电子显微镜使用电磁透镜的电子束聚焦的图像所有类型的材料在空间分辨率远远超过获得的标准光学显微镜。通常有两种类型的电子显微镜,透射电子显微镜(由Ruska类型)和扫描电子显微镜。这两种类型也被杂化生产扫描透射电子显微镜和扫描电子显微镜配备透射探测器。尽管技术的成熟,新技术的发展继续推进的极限分辨率。³

电子显微镜的分辨率是多少?

电子显微镜的分辨率取决于几个因素,核心是加速电压如上所述。但是其他因素也很重要,如磁透镜的显微镜,在电磁透镜畸变的影响。⁴电子显微镜的分辨率限制不同类型和复杂性表2中列出。注意,这些现代TEM设计能够实现原子分辨率。

表2:各种类型的电子显微镜的空间分辨率。

类型的电子显微镜	典型的空间分辨率
桌面SEM(紧凑版本可以坐在一张桌子——热发射源)	~ 3 -15海里
热发射电子扫描电镜来源	3海里
肖特基场发射扫描电镜	0.6纳米
120千伏TEM	0.2纳米
200千伏TEM	0.1纳米
300千伏TEM	0.1纳米
300千伏TEM和像差校正	0.06纳米

类型的电子显微镜和它们是如何工作的

透射电子显微镜(TEM)

在TEM,一束电子的加速传播通过样本,样本以不同的方式相互作用获得不同类型的信息,在被发现之前荧光屏,电影或是从汤姆斯探测器以下样品。通过样品的光束传播,在TEM有两种基本的需求。首先,加速电压必须足够高的电子束可以通过样品没有被完全吸收,其次,协助这个要求,样品必须薄,通常在厚度100海里。后者要求是一个函数的平均原子序数的样本。更重的元素,金属和合金将更强的电子吸收和宽大的样品厚度。另一方面,生物样本,主要由C、H、O、N和这些低原子序数的元素,不容易吸收电子,可以容纳更厚的样品。生物样本通常是由ultramicrotomy,样本嵌入塑料树脂,然后使用切片机切片与玻璃或钻石刀。无机材料也可以准备,但通常他们切成3毫米磁盘,机械抛光最后变薄与离子束或穿孔电解溶液。穿孔周围的区域,将足够薄的电子传输。轻微的缺点是,这些样本将逐渐厚进一步从穿孔,所以样品厚度的影响将减少传播。 Alternatively, one can use a focused ion beam instrument to pick out a specific area of the sample, remove it, attach to a TEM sample carrier and thin it down to ~100 nm using a focused Ga⁺离子束。这个的优点是精度示例选址和生产相对均匀厚度的样品。然而,仪器是昂贵的和大量的操作技巧是必需的。

一个原理图描绘的主要电子光学元素TEM图1所示。在(a),操作的TEM明场成像模式显示。这开始的顶部与源的电子仪器,最常见的一个钨丝(电子热排放)和场致发射源(高潜力应用于提取电子从源端)。场致发射源可能是热辅助(称为肖特基场发射源)或不(称为场致发射冷源)。然后使用一组电容器镜片形状的梁上,通过样本。图像的聚焦光束通过标本后进行使用一组镜头(客观、中间和投影仪镜头)。最终的图像形成荧光屏幕上(电子造成的影响发射的光),胶卷或是从汤姆斯探测器(如charge-couple设备(ccd))。

图1: 原理图的TEM (a)亮视场成像模式和(b)电子衍射模式。

然而,图像是没有多大用处,除非他们展示一些形式的对比。有不同的方式在TEM形成对比。例如,许多类型的样本成像在TEM将晶体的性质,和法律的主题电子衍射的布拉格方程:

电子的波长λ,d是面向特定的晶格间距的飞机,θ是布拉格衍射角和n是反射。用TEM在200千伏电压加速,波长是0.00251海里(表1)。使用金属中原子的晶体飞机与飞机之间的最大间距(铜(111)面铜)作为一个例子,d-spacing为0.207海里,我们可以解出sinθ。

这告诉我们的是衍射的布拉格角几乎平行于电子束。这意味着晶体飞机离否则传输光束衍射强度一致时几乎平行于电子束。这表现为屏幕上的图像或电影深色区域。这种类型的对比被称为衍射对比,一个可以学习很多关于样品的晶体结构使用这种形式的对比。此外,样本可以在TEM倾斜,可以产生一系列的图像,不同的晶体飞机进入布拉格衍射条件提供更多信息。

电子衍射模式实际上可以记录由TEM操作在一个稍微不同的方式。插入下面的物镜孔径物镜在图1中被允许衍射光束传播。下面的镜头配置以一种稍微不同的方式允许衍射光束投射到屏幕图像以及强烈的光束集中在传输衍射模式。样品和屏幕之间的距离是已知的,波长。这些模式可以被索引以获得晶体与复合识别信息和帮助,所有化合物都有特定的晶体结构和晶格间距,可以确定从现成的模式和数据匹配晶体库⁵大多数学术机构的许可或至少是老派卡片目录。

第二种类型的对比形成常发生的是原子序数反差。在其最简单的形式,这是指电子吸收一些高原子序数的元素在示例中,将他们的能量转化为热量。一旦吸收,这些电子不能传输通过样品,剩下的黑暗区域下面的屏幕上的图像。然而,由于电子加速电压高和薄样本,这种形式的原子序数反差不是最普遍。更容易发生是一个互动的带负电荷的电子束与原子核的积极的潜力将散射电子的轨迹又导致强度成像屏幕上的赤字。

这些机制都不可能发生在一个生物样品,因为他们通常不显示高程度的结晶度,和他们通常也不显示大量的原子序数反差,主要由低原子序数的元素,如C, N, O和h .援助之下,较低的加速电压经常使用,但更重要的是样品在准备进行一个额外的步骤染色。尽管有许多不同的染色配方生物样品,常用的组合是醋酸双氧铀及柠檬酸铅。注意都含有重金属,U和Pb将对比成型机。这两个污点将绑定到不同的细胞结构和他们的使用提供了所需的对比识别不同的细胞和组织内的细胞器。结果是一个TEM图像如图2所示的人类肥大细胞。

图2:生物样品的例子,高压冷冻、染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅和TEM的可视化。 野生型人类肥大细胞1号线(HMC-1);图像显示了细胞的细胞核和黑色箭头表示核膜崭露头角的事件。信贷:约翰娜,这位Dimitra Panagaki雅各克罗夫特,复制下创作共用署名3.0 Unported 3.0 (CC)许可证。

TEM的获得关键信息和样品要求总结如下:

●非常高的空间分辨率的图像(~ 0.04海里高端现代工具,轻松实现原子分辨率)。

●晶体晶格缺陷和错误信息包括直接成像在晶体材料。

●需要加速电子在高电压(通常是100 - 200 kV但范围可以从40 - 300 kV商业工具)。

●样品需要薄允许电子传输通过样品(~ 100海里)。

●生物样品需要某种形式的重金属染色、协议使用醋酸双氧铀及柠檬酸铅是最常见的。

扫描电子显微镜(SEM)

电子显微镜的扫描电子显微镜是我们大多数人很可能更熟悉。这些图片我们看到一只苍蝇复眼的是使用扫描电镜。但有趣的是,他们的发展滞后与TEM。一个很棒的SEM的早期发展的历史是由麦克马伦提供的。⁶

有两个主要SEM和TEM之间的区别。在扫描电镜,x - y方向的聚焦电子束扫描样品。TEM的梁不扫描,除非用于扫描透射电子显微镜(干细胞-见下一节)。其次,没有要求样品薄。样品的表面是什么样品的检查,也许唯一的限制是它必须能够被插入或适合分析室。

扫描电镜的示意图如图3所示,由许多相同的元素TEM。它始于一种电子顶部的列,再一次,可能是一个W丝热发射源或一个肖特基热辅助场致发射源。一些仪器使用冷了场致发射源,但这些都是例外超过标准。就像TEM有一系列冷凝器镜头,协助塑造梁和调整电子束电流,最终影响的示例。一个带光阑也协助——光阑将导致小束水流和光束直径(最终决定了空间分辨率)。光束穿过样品的扫描线圈光栅尺寸选择的用户通过选择放大,而选择与光栅检测到信号同步的。更高的放大扫描光束在越来越小的地区。最好的物镜聚焦光束直径。光束直径越小,越细样品的特性,可以解决。与现代仪器,列在物镜的面积一直在修改,我们将回到这个“SEM探测器”部分。

图3: 扫描电镜的示意图。

一个示例提供的3 d图像的本质SEM stereoocilia包所示的内耳如图4所示。

图4: 扫描电镜图像的例子。SEM图像的感觉头发束一个头发细胞从水龟的内耳听觉器官。由声音振动导致头发来回移动,交替刺激和抑制细胞。当细胞刺激会导致神经冲动形成的听觉神经,发送信息到大脑。来源:大卫·Furness博士复制下创作共用署名3.0 Unported 3.0 (CC)许可证。

扫描电镜设施被发现在学术、商业和工业中心。可能是没有材料,尚未在扫描电镜检查。应用包括那些期望——生物学、材料科学和纳米技术——还在取证等领域,⁷艺术的保护⁸和化妆品。⁹

电子束/样本体积相互作用

当一个高能电子束罢工一个样本,来自许多不同的信号从样品表面产生不同的深度。这些可以发现和利用提供了丰富的关于样品的信息。这beam-sample交互,它产生的主要信号,如图5所示。

• 俄歇电子低能量的电子发出样品的表面附近地区和有能量的特征元素释放。他们是专门用于俄歇电子能谱学而不是SEM的工具。
  
  
• 二次电子来自深处的样例和非弹性散射的结果主要梁。主要与电子束在样品和传授一些能量。这些次级电子可能退出样本被检测到。这些电子也通常低能量和提供丰富的地形信息的样本。
  
  
• 最后,还有的情况再次的主要电子与原子核相互作用原子在示例,其轨迹是逆转远离标本。这些被称为背散射电子样本中,来自更大的深度,具有更高的能量,有效弹性散射。因此,背散射电子图像可以给定性信息元素的相对原子序数在示例。
  
  
• 还深入梁/样本交互体积,特征x射线也可能被用来生成定量确定样品的化学成分。
  
  

图5: 电子束/样本交互产生样本内的各种信号从不同的深度。俄歇电子,二次电子、背散射电子和特征x射线。

排放这些不同的信号的深度不是常数,高度依赖于电子束的加速电压和样品成分。这些信号的典型梨-形状的体积都将在接近样品表面加速电压越低,原子序数越高。这是特别关键的特征x射线辐射。当电子束罢工的示例,它可以把电子从内层轨道。这些空缺由从外层电子,在这个过程中,发射x射线从它起源的特征元素。这是一个辅助微束分析技术的基础上是很常见的SEM的x射线能谱分析(EDX)。然而,x一代发生的体积比电子束的直径要大得多,所以如果我们检测和地图元素的特征x射线的分布在示例中,空间分辨率取决于交互体积的大小而不是电子束的直径。改善这一问题的一个方法是降低加速电压。这减少了交互作用的大小体积和提高空间分辨率的x射线图。

探测器在扫描电镜

每个SEM有Everhart-Thornley二次电子探测器,它使用一个积极偏见法拉第笼吸引二次电子。这些电子加速对闪烁体,它们产生光子,这是进入一个光电倍增管,信号放大和测量。通过应用法拉第笼小正电压,可以过滤掉低能量电子和检测只有更高的能源背散射电子。然而,这种做法并不像过去那样普遍是由于固态背散射探测器的发展,这是典型的环形探测器直接安装在物镜或位于一个活塞,可以插入和收回到相同的位置(参见图6 -可伸缩的背散射电子探测器)。注意,这些背散射电子也受到布拉格衍射定律和谨慎的样品制备,晶体也可以获得信息。这是被称为电子背散射衍射技术的基础,或EBSD。

大多数现代SEM的会有一个或多个探测器“镜头”。这种类型的配置如图6所示。在这种情况下,产生的磁场电磁物镜和静电透镜是用来收集和漏斗的低能量的二次电子备份列检测。磁场是高效收集这些低能量电子和这探测器,与后向散射镜头探测器一样,是非常有用的操作时以非常低的加速电压(100 V, 3 - 5 kV)的样品必须在几毫米物镜保持精确聚焦的电子束。然而,这也可能是镜中的探测器的缺点之一,正是这些非常低能量的电子将最容易文物样品收费,这发生在当样本不接地和建立在分析。这是常见的绝缘样品进行了分析和解决应用程序(5 - 10海里)薄膜的碳或进行一些金属(金、Pd和Pt常用)使用一个蒸发或溅射涂布机,是一种常见的配件在每个扫描电镜实验室。

图6: 原理图的周围地区现代电子显微镜的物镜,显示双电磁和静电收集的镜头和二次电子的轨迹的行为这两个镜头的列上二次电子和背散射电子探测器。

的关键信息,我们可以获得一个SEM和任何特殊的样品需求总结如下:

●高空间分辨率的样品表面(~ 0.5海里)提供三维地形信息与二次电子。

●定性成分差异样品用背散射电子(也可能获得与EBSD探测器晶体信息)。

●使用时可能非常敏感的表面在低电压由于电子束/样本交互量的减少。

●在这些条件下镜头探测器是非常有效的。

●用EDS定量元素分析可能的。

●真的是没有限制的样本大小,除了它必须能够被引入,适合分析室。

扫描透射电子显微镜(茎)

茎几乎什么听起来- TEM和SEM。事实上,如今大多数TEM的组合系统,可以在TEM或阻止模式操作。像TEM样品仍然需要电子透明,但添加光栅光束在TEM的能力允许使用额外的信号不能空间协调在传统TEM。这些包括分散主梁电子,特征x射线和电子能量损失事件。TEM的特殊空间分辨率,小直径的电子束聚焦在样品表面。特征x射线可以检测并映射就像他们是在扫描电镜。然而,交互体积的大小的问题消失了,因为样品薄。当电子产生的x射线,他们失去的能量是等效的,当一个电子能量损失谱仪(鳗鱼)连接到仪器、损失事件也可以映射位置的函数示例。鳗鱼有两个主要优势在EDS -地图会稍微更好的空间分辨率和化学环境技术敏感,因此可以提供联系信息和氧化态和x射线光电子能谱(XPS)类似,但在更高的空间分辨率。

干细胞的应用到许多不同的领域的研究,包括生物学、¹⁰和纳米技术。¹¹

反射电子显微镜(快速眼动)

反射电子显微镜是电子显微镜的一种形式,也有其起源来自恩斯特。¹²REM通常是由倾斜TEM但执行样品的电子束在接近掠入射到样品表面。样例因此不再需要电子薄而透明。因此,电子束与样品的相互作用是少得多,结果从样品表面获得信息。因此技术用于研究晶体表面。应用程序的示例包括表面形貌的研究,观察表面结构、表面吸附和氧化过程。¹³这多少有点专业的方法,不是那么常用SEM, TEM和阀杆。

冻结骨折电子显微镜

冷冻断裂电子显微镜是一种为方法用于生物研究和特别有价值的作为成像膜结构的一种手段。当生物样品在冷冻状态下,膜疏水内部有一个薄弱面。如果样品然后破碎,它将沿弱面,经常把膜分成两半,每个对应一个磷脂单层与蛋白质有关。这产生一个三维的视角的膜性组织细胞,随着膜内部的观点。这些细节都是在电子显微镜下可见蒸发Pt的标本在一个角度,有效地让Pt-C副本的破裂面。

有四个主要步骤的标准冷冻断裂副本:

我)快速冻结的标本

(二)低温压裂的标本(-100°C或更低)

3)使复制的新暴露的冷冻真空沉积表面的Pt和C

(四)干净的复制品使用漂白剂或酸的生物材料

一个完整的过程是由服务器。¹⁴一个典型的图像显示脂滴分布的周围巨噬细胞的内质网如图7所示。

图7 :冻结骨折电子显微镜图像显示脂滴的例子(LD)和巨噬细胞的内质网。信贷:从Robenek和塞维¹⁵复制下创作共用署名2.0通用(CC - 2.0)许可证。

该领域的最新发展:低温

低温EM是一个工作流/显微镜了解决生物电子显微镜的一个长期存在的问题——如何看本国国内的生物样本。低温EM的发展的影响是公认的在2017年被授予诺贝尔化学奖。¹⁶这一直是一个问题,生物样本包含了大部分的水,这是典型的样品制备过程中删除的协议(如化学固定或冷冻干燥。在低温EM,样品在低温下保持在所有阶段的样品制备和TEM分析。学习的方法是特别有用蛋白质结构在原生状态,也许是最著名的,至少最近,确定峰值的蛋白质的结构¹⁷小说的冠状病毒。¹⁸它在蛋白质分析发现效用生物制药了。低温EM的一个例子可以用来获取样本的图像,如细菌,以及其在低温中使用EM断层产生三维重建图像如图8所示。¹⁹这是通过简单地获取大量的图像相同的部分在不同角度入射电子束。

图8: 使用低温EM断层扫描图像细菌细胞的内部结构。(a, b)的螺旋结构类核的细菌(a)展示21 nm厚层析片通过细胞的三维体积和(b) 3 d表面呈现相同的细胞,与螺旋类核(黄色)。(c)更高的放大视图层析片通过细胞,显示布置得井然有序类核螺旋和核糖体(暗点)在类核的边缘分布。(d)扩展视图21 nm厚的层析片,显示顶部极性化学感受器的数组。图解模型(插图)说明了化学感受器数组的空间排列在平面上的膜。信贷:米尔恩等。 ¹⁹

该领域的最新发展: 现场 TEM

另一个领域的研究获得关注最近的现场TEM,动态过程是在原子尺度附近被跟踪^20.通过专业的发展环境对TEM持有者。生物矿化过程可以遵循现场这可能在骨愈合和修复提供洞察力的硬组织。²¹细菌的作用在环境中金属的自行车²²也一直是使用吗现场TEM,结果可能在环境科学有着重要的意义。Host-pathogen交互²³也被研究过交战规则提供了新的信息。600年镍基合金的氧化现象,用于压水堆核电²⁴系统,也一直在研究和新工艺可能影响应力腐蚀开裂行为观察。

引用

1。超越衍射极限。Nat光子学。2009;3 (7):361 - 361。doi:10.1038 / nphoton.2009.100

2。诺贝尔奖。https://www.nobelprize.org/prizes/physics/1986/summary/。2021年8月25日,通过。

3所示。stephen yang r .显微镜革命席卷材料科学。自然。2018,563 (7732):462 - 464。doi:10.1038 / d41586 - 018 - 07448 - 0

4所示。HH上升。历史方面的畸变校正。J电子Microsc(东京)。58 2009;(3):77 - 85。doi:10.1093 / jmicro / dfp012

5。国际中心的衍射数据。https://www.icdd.com/。2021年8月25日,通过。

6。麦克马伦d . 1928 - 1965扫描电镜。扫描。1995;17 (3):175 - 185。doi:10.1002 / sca.4950170309

7所示。Basu美国法医科学的扫描电子显微镜。:分析化学的百科全书。约翰•威利& Sons有限公司;2006年。doi:10.1002/9780470027318. a1122

8。Zagora j . SEM-EDX色素分析和Multi-Analytical Francesco Fedrigazzi地面和油漆层的研究从Kostanje绘画。CeROArt。2013;(鸡蛋3)。doi:10.4000 / ceroart.3248

9。Kaliyadan F, Gosai B,艾尔Melhim W, et Al。扫描电镜研究毛干损伤继发于头发的美容治疗。Int J毛发学。2016;8 (2):94。doi:10.4103 / 0974 - 7753.188035

10。苏萨AA, Leapman RD。茎的开发和应用生物科学。Ultramicroscopy。2012;123:38-49。doi:10.1016 / j.ultramic.2012.04.005

11。van den Bos KHW Altantzis T,德支持者,van Aert年代,巴尔斯美国最近突破扫描透射电子显微镜的小物种。阿德phy X。杂志2018;3 (1):1480420。doi:10.1080 / 23746149.2018.1480420

12。Ruska大肠死elektronenmikroskopische Abbildung elektronenbestrahlter Oberfl一个陈。Zeitschrift fur phy。1933;83 (7 - 8):492 - 497。doi:10.1007 / BF01338960

13。八木天线反射电子显微镜。J: Crystallogr。1987;20 (3):147 - 160。doi:10.1107 / S0021889887086916

14。塞维新泽西。冷冻断裂电子显微镜。Nat Protoc。2007;2 (3):547 - 576。doi:10.1038 / nprot.2007.55

15。Robenek H,塞维新泽西。在冷冻断裂电子microscop最新进展:副本immunolabeling技术。proc在线杂志。2008;10 (1):9-19。doi:10.1251 / bpo138

16。诺贝尔奖。https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2017/press-release/。2021年8月25日,通过。

17所示。王Wrapp D N, Corbett KS, et al . 2019 -低温电子显微镜结构ncov激增十二构象。科学(80 -)。2020,367 (6483):1260 - 1263。doi:10.1126 / science.abb2507

18岁。墙壁AC,公园Y-J Tortorici妈,墙,McGuire, Veesler d结构,功能和抗原性的糖蛋白SARS-CoV-2飙升。细胞。2020,181 (2):281 - 292. - e6。doi:10.1016 / j.cell.2020.02.058

19所示。米尔恩JLS组合、Borgnia MJ, Bartesaghi et al .低温电子显微镜——non-microscopist底漆。2月J。2013年,280 (1):28-45。doi:10.1111 / febs.12078

20.龚C Pu年代,罗伯逊哦。液体细胞透射电子显微镜及其应用。R Soc开放科学。2020;7 (1):191204。doi:10.1098 / rsos.191204

21。他Sawczyk M K,刘C, et al。揭示纳米羟磷灰石的矿化途径原位液体细胞透射电子显微镜。Sci睡觉。2020;6 (47):eaaz7524。doi:10.1126 / sciadv.aaz7524

22。Couasnon T, Alloyeau D,对B, F平顶山,Ghigo J-M, Gelabert a .原位监测exopolymer-dependent Mn矿化细菌表面。Sci睡觉。2020;6 (27):eaaz3125。doi:10.1126 / sciadv.aaz3125

23。Dearnaley WJ Schleupner B, Varano AC, et al。Liquid-cell电子断层扫描的生物系统。纳米列托人。2019;19 (10):6734 - 6741。doi:10.1021 / acs.nanolett.9b01309

24。伯克毫克,Bertali G, Prestat E, SJ Scenini F,黑格。原位分析的应用透射电子显微镜研究优惠晶间在600合金氧化。Ultramicroscopy。2017;176:46-51。doi:10.1016 / j.ultramic.2016.11.014