电生理学原理、膜电位和电生理技术

电生理学测量电活动,或“兴奋性”,生物细胞(无论是肌肉细胞、神经元或干细胞)。这可以在单细胞水平上完成,也可以包括从成百上千的细胞同时测量。

本文重点介绍单细胞电生理学和介绍了电生理学的基础调查通过描述动作电位的离子基础和不同的电生理技术用于探索和理解的组织和器官。

简单地说,电生理学是研究细胞内生物电路的电气性能,组织,器官和系统。

在最简单的层面上,任何电子电路(如无线电或电脑)包含一个电池通过铜线连接到组件,通过带负电荷的电子流动和工作,服从欧姆定律:电压(V) =电流(I) x电阻(R)。

在生物学上,兴奋细胞同样遵守基本法律,但费用是由原子的解决方案- - - - - -氯离子((Cl^{- - - - - -})、钠(Na⁺),钾(K⁺(Ca)和钙^{2 +}))。这些离子的流动是由离子通道- - - - - -酶催化的被动流动离子电化学梯度(在下面描述)。这些离子通道是由不同的基因编码的蛋白质。物理电子电路是一样的,但是生物复杂性的增加了几层。

因为Galvani动画青蛙的腿用金属电极在1700年代末,科学家在物理学和生理学的交集先锋的我们理解细胞“兴奋”。¹

电生理学理论的进步,技术和设备在过去的几百年里大大放大我们了解身体是如何工作的,包括基础知识的心脏,大脑和其他器官,和提高疾病的诊断和治疗。

早期的见解是意识到带电离子在溶液中可以移动,产生电压的差异,一个物理现象的解释能斯特方程阿切尔(读历史,1989)。然后在1950年代初,何杰金氏病和赫胥黎显示神经元动作电位的离子基础,²煽动紧张的调查来了解分子机制基本动作电位。³技术进步在电极设计了并行执行。⁴他们的论文发表在1981年,Sakmann和Neher膜片钳电生理,开创性的使用玻璃能够测量离子流的微量吸液管通过单一离子通道或在一个单一的细胞膜。⁵这种技术把爆炸对我们理解可兴奋细胞如何工作和兴奋性使科学家调查的基本机制和大脑功能⁶的帮助下

膜电位、动作电位的步骤和动作电位图

膜电位

膜电位的电压或电位差穿过细胞膜。潜在的差异是由疏水膜分离引起的费用,作为电容和电阻带电离子的运动。

主要细胞离子携带电荷Na⁺K⁺、钙^{2 +}和Cl^{- - - - - -}。这些细胞内外离子浓度不同。所以当离子通道打开,离子想去平衡他们的浓度。

一般来说,Na⁺、钙^{2 +}和Cl^{- - - - - -}离子浓度存在于更大的细胞外K⁺离子浓度大的细胞,在细胞的净负电荷。这设置一个电化学梯度(或“驱动力”),这样当一个离子通道打开,离子渗透流的跨膜电化学梯度携带电荷和电压变化。这导致细胞膜去极化或超极化的潜力。

带正电的离子Na⁺和Ca^{2 +}有一个电化学梯度有利于他们的运动到带负电荷的细胞,所以他们的正电荷吗去偏光电化学势。另一方面,K⁺细胞内离子高度集中,所以他们的驱动力是相反的方向,从细胞。结果,他们携带正电荷的细胞,使细胞的膜电位更负;这就是所谓的超极化。

通过疏水离子不能自由扩散细胞膜脂质双分子层,但他们可以通过移动通道或孔隙设置在扩展跨膜从内部到外部。很多这些通道是高度选择性的只一种离子,通常只在应对“封闭”,开放的改变膜电压(电压门控离子通道)或绑定的小分子配体(ligand-gated离子通道)。

离子跨膜流动集整体阻力(根据欧姆定律)。如果有大量的通道打开,膜电阻(Rm)将低,开放更多的频道,更多的离子可以流,因此产生电导和较小的阻力更大。

脂质双分子层的另一个重要属性是它的电容(膜电容,厘米),起源于双分子层的物理性质;绝缘体沉浸在两侧进行解决方案。有一个电荷的分离膜与跨膜电位差。净效应是通过离子通道的离子流动之前必须先收膜电容器膜电位的变化。因此,细胞和大电容和小电导会改变潜在的缓慢,而细胞较小的电容将很快改变。这种变化的速度通常被称为膜时间常数,Rm。厘米=τ。这个属性的神经元有深远的影响的时间间隔突触电位将求和分级电位(见下节)。

动作电位步骤和图

可兴奋细胞通常有大约-60 mV的静止膜电位(负在测量时对细胞的外)。骨骼肌、心肌和表达神经元电压门控钠⁺通道和电压门控钾⁺频道。

在动作电位,电压门控钠⁺通道开放允许快速涌入的Na⁺离子和快速的细胞膜去极化潜力。如果这一切发生,那么可能会去~ + 40 mV,呆在那里。但是,这强烈的去极化打开电压门控钾⁺通过哪些渠道K⁺离子流动方向相反,把电压(再极化)约-60 mV。具体的时间和动作电位的波形的类型和密度决定可兴奋细胞膜离子通道存在,如图所示为神经元和心肌细胞在图1和图2,分别。

图1: 神经元动作电位。

神经元

1)动作电位必须由一个小的静止膜电位去极化(约-60 mV);这可能是由于突触输入,例如。当去极化达到“阈值”,这个触发电压门控钠开幕⁺渠道(-55 mV)。2)这将导致快速涌入的Na⁺离子去偏光膜的40 + mV。3)钠⁺渠道灭活(关闭)的一种形式在一毫秒左右,和电压门控钾⁺通道开放。4)K的流出⁺离子再极化膜回到-60 mV或超越更多的负电位,导致afterhyperpolarizing潜力。5)慢得多的时间尺度上,微小浓度的离子交换膜被包围的Na抽回来⁺/ K⁺换热器(有时称为离子泵)交换K⁺和钠⁺静态电位离子重新设置和维护。

图2: 心脏动作电位。

心肌细胞

1)快速Na⁺通过电压门控钠流入⁺渠道去偏光细胞膜。2)电压门控钾⁺通道开放,开始复极化。3)电压门控钙^{2 +}通道开放和Ca的涌入^{2 +}正电荷被K的流出平衡⁺正电荷,产生一个高原阶段。4)Ca^{2 +}通道关闭和K⁺渠道保持开放,再极化膜电位-90 mV。

动作电位时发起细胞膜去极化的Na的门槛⁺通道激活。在神经元动作电位是神经元沟通的基础。

分级电位是亚阈值对刺激做出反应膜电位的变化或从其他细胞传入神经支配。这些可以兴奋性突触后电位(去极化)或抑制(超极化)取决于渠道的类型要求。亚阈值的影响反应在启动一个动作电位是由许多因素决定的,包括:输入的大小和它的后续反应,动作电位的起始的距离,和细胞膜的生物物理性质,如膜时间常数τ。在实践中,graded-potentials总和上彼此的过程被称为亚阈值集成。(图3)。

图3: 分级的潜力。

电生理学家测量小细胞电流pA的顺序- - - - - -nA。因此,他们需要敏感的设备,可以排除振动和电子干扰(噪声)的周围环境。所需的标准平台设置在体外和在活的有机体内电生理学是如下图所示(图4)。

图4: 标准电生理学钻机设置。

1)空表,以防止物理振动运动构件添加到实验记录。

2)一个法拉第笼保护设置的电子干扰。消除环境电噪音获得清晰是至关重要的,有用的电生理记录。

3)显微镜和显微操纵器(s)的位置微电极(年代)。根据实验的设置,用户可能包含多光子成像功能。为在活的有机体内调查,用户可能会选择将显微镜,为不同的设备,比如跑步机。

4)一个放大器需要收集和放大了的信号从你的电极。这是连接到一个数字转换器将模拟信号转换成数字信号。

5)数据采集和分析软件需要设置实验,设计和运行协议和从收集的数据中提取有意义的结果。

另外,用户可能需要考虑将药物输送系统和温度控制设备。

膜片箝

膜片钳电生理技术开创Sakmann和内尔在80年代和1970年代⁵和他们分享了1991年的诺贝尔生理学和医学奖。它涉及创建一个串联电路的细胞或补丁没有刺穿细胞壁细胞膜。相反,一个玻璃微量吸液管充满离子溶液和含银/氯化银导线连接到一个膜片钳放大器之间形成高阻gigaohm密封片和玻璃吸管的口。不同的膜片箝配置:cell-attached,全细胞,由内向外和外部;如图5所示,改编自原来的纸。⁵这个数字突显出关键路径用来进行全细胞在体外膜片箝记录。

全细胞的配置是通过接近细胞膜与毛细玻璃微电极已micro-forge加热,把这口直径是~ 1µm 2和6 MΩ之间的电阻,和吸管抵消调到零位。

酒窝是观察到灌装的微量吸液管内部的解决方案和应用正压(< 2毫升)的吸管接触细胞膜。通过指挥5 mV一步脉冲电极,我们可以用这个作为一个密封测试理解当我们有一个补丁密封的细胞。释放的正压膜和吸管口成为连续的,形成一个松散的补丁,增加阻力,减少当前的振幅在5 mV密封测试。光吸收进步的“补丁”膜的口吸管,这被称为cell-attached配置和生成一个高阻(GΩ)密封毛细管玻璃和膜之间的补丁。这通常减少了观察密封测试电流快速平线有两个吸管电容瞬态电压步骤的开始和结束。这些都是通过膜片钳放大器电路。

“之前全细胞”,电极表面轻轻拉出,优势的细胞,去除细胞核的风险补丁和增加的封锁阻力。细胞是举行一个负电位约等于静止膜电位(-60 mV)和负压应用于膜破裂。断裂意味着吸管的解决方案现在连续细胞质,和整个细胞的电特性与吸管电极串联。这意味着全细胞的兴奋性膜现在可以测量和操纵。

图5: 如何实现不同膜片箝配置。

在全细胞的配置,可以研究细胞的电特性在current-clamp和电压钳模式。

Current-clamp

在current-clamp模式下,用户注入一个已知电流振幅的内部细胞通过设置和观察细胞兴奋性的变化,以应对这些电流注入。它是一个有价值的技术,因为它可以模拟生理的场景,像一个突触输入。在图6中,您可以看到一个细胞的反应增加一步电流注入-20 pA + 20 pA在10 pA的步骤,这样+ 10 pA的电流注入足以使细胞动作电位阈值和火。⁷总结情节意味着当前injection-firing率关系的多个单元如图6 b之间有一个积极的关系目前的注入和发射率的细胞。

图6: 当前的鼠标AgRP夹调查神经元在大脑切片制备。信贷:布兰科et al . 2016,⁷复制下Creative Commons归因4.0国际许可证。

电压钳位

在电压钳模式下,膜电位夹在指定的电压。启用了夹反馈放大器和headstage,注入电流保持细胞的膜电位不同的命令和用户设置的电压。

离子通道打开不同命令电压,即膜电阻变化离子跨膜电流流动。即时反馈放大器补偿通过注射倒数电流维持细胞在命令电压,给读的膜电流注入电流。

虽然它不是一个细胞的生理测量离子特性,它被证明是一个非常深刻的方法在调查电导背后存在于细胞膜和细胞兴奋性。²尤其有帮助当结合药理不同电导的阻滞剂。在图7中,神经元的梯形体的内侧核(MNTB)和横向上橄榄(缩孔)研究了老鼠的听觉脑干的电压钳位Na的存在⁺通道阻滞剂孤立K⁺电导。⁸这个实验的目的是探讨这样一个电压门控钾的相对贡献⁺通道(K_V3.1)总K⁺电导通过记录电流在不同电压命令没有步和K的一个已知的拦截器的存在_V3.1 K⁺四乙铵(茶)。图表明,茶降低整体的振幅峰值外K⁺目前50% ~ 40 + mV MNTB和交响乐团神经元。这表明,K_V3.1通道调节细胞外K的50%⁺电导。

图7: 电流电压的关系 K⁺ 电流测量在听觉脑干细胞。电流跟踪观察到细胞MNTB (A)和交响乐团(B)。电流电压关系曲线(IV) MNTB (C)和交响乐团(D)的振幅峰值和持续的电流电压记录在每个命令。电压命令步骤插图(C),峰值电流在茶的缺失和存在(1毫米)MNTB (E)和交响乐团(F)。信贷:Choudhury et al . 2020年,复制下创作共用署名4.0国际许可证。

该技术涉及到将钢丝电极或硅探测器直接进入主题在活的有机体内或分层的主要细胞,培养细胞或组织在电极片体外。

为体内细胞外电生理学,电极直径一般薄,滑落到邻近的组织细胞。这种技术的优势细胞内的电生理学是它可以执行在清醒,表现主题,提供更大的洞察力的神经活动的行为。电极可以安排为:

• 单电极——一个电极,一个记录
• 四极管——四电极捆绑在一起,使更好的细胞分类
• 多级阵列(量)阵列的多个记录电极,记录飙升在更大区域的组织

电极记录激增产生的电场电位或“解雇”神经元。这些波形称为“局部场电位”和飙升的可以由多个单元相邻的电极。神经元的数量一个电极或硅探测器可以“倾听”依赖于电极的阻抗和记录网站(频道)的数量。

单一单元记录

研究人员必须仔细准备他们在执行在活的有机体内电生理学实验(图8)。从脑组织录音需要删除的部分头骨进入大脑。电极必须通过组织先进慢慢~ 1µm每秒的速度,防止机械应力,避免造成流血的组织。使用显微操纵器促进。实验者知道他们的位置在大脑中“归零法”显微操纵器的坐标时,电极触动大脑的表面。他们可以比较他们的立场发表脑图谱坐标,如艾伦大脑图集。一旦在他们感兴趣的领域,实验者可以移动探测器或电极进行精细控制的改善记录富达神经元通过微硬碟机感兴趣的。

从电极信号放大并使用一个示波器实时观察。实验者也“倾听”细胞活动飙升通过连接一个音频设备输出响应峰值噪声。⁹实验使用转基因动物主题表达脑细胞也可能结合在细胞类型的兴趣在活的有机体内电生理学与optogenetic刺激通过使用一个光源照射他们感兴趣的神经元。^9,10

高峰排序算法和软件使用户能够局部场势成单个单元,或神经元,记录后进行分析。¹¹作为数据记录在这一步是至关重要的在活的有机体内录音可以非常吵。

图8: 在活的有机体内电生理记录设置。微电极下降到组织使用显微操纵器。微电极的微硬碟机使细定位一旦在正确的区域。使用显微镜操作符,使电极的正确指导和跟踪。来自组织的信号放大的放大器和活动是示波器跟踪。计算机可以记录、监视、分析和控制的实验通过数字接口和放大器。

多部件记录

最近,技术的进步在电极设计导致Neuopixels探针的发展。¹²这些探针使用互补金属氧化物半导体(CMOS)技术,从成千上万的神经元同步录音。¹³这个数字将增加继续进步的大小使小型化技术。

Neuropixels的优点是很多记录网站提供的前所未有的分辨率以及电极的柄。然而,缺点是信息只能从神经元相邻的单轴项目进入脑组织。这可以在一定程度上克服通过结合多个电极在不同的站点/录音。但是,有一个实际的限制可以放置的电极数量。

解决方案如CMOS-hosted在活的有机体内多级系统(一致)从数百个电极扩散使记录3 d安排。电极组成数百glass-ensheathed项目从一个CMOS放大器阵列微电极。¹⁴这些使监测神经活动在更大的空间区域。

多级阵列(MEA)

阵列的多个电极在培养皿中可以用于更高的吞吐量细胞外记录层的细胞在体外,或从大脑切片。是系统已经用于临床前和药物发现研究50多年了。¹⁵

这道菜的电极排列在底部网格中像一个棋盘。然后细胞培养在他们之上,或组织切片放在上面。细胞活动和局部场电位测量细胞外地。通过记录同时从多个电极,研究人员可以研究网络动力学在组织或细胞之间,以及收集数据从多个细胞,增加这些实验的吞吐量。

就意味着设计而言,电极每口井的数量增加了这些年来,随着新技术的出现,比如CMOS数组。这意味着每盘电极的数量从64猛增到1000 +,改善分辨率科学家们观察和记录细胞活动。

电生理学的调查:	细胞内的	细胞外
记录:	研究单个细胞	同时记录多个细胞
准备:	可以在活的有机体内或在体外	可以在活的有机体内或在体外
可能的配置:	全细胞、cell-attached loose-patch,单通道,穿孔修补,由内向外,外部配置	意味着,心脏电生理学、高通量、自动化电生理学
吞吐量:	中,低	高
实验能力:	电压钳,current-clamp和动态夹可能	通常只current-clamp配置是可能的。虽然可以配上电或optogenetic刺激

临床前研究

这两个在体外和在活的有机体内电生理学是广泛用于临床前和学术研究。使用这些技术,对我们理解行为神经科学作出了重大贡献——神经,神经生理学和神经药理学,心脏病学和毒理学。此外,电生理学依然是“真实”试验时测量神经活动。¹⁶

药物发现

介质高通量电生理学系统用于化合物筛选或在细胞毒性分析。一些系统可以自动“补丁”细胞,而其他人使用电极阵列测量局部场电位从细胞。根据应用程序,高通量电生理学系统可用于测量细胞收缩,阻抗和其他化验。¹⁷

临床电生理学

临床电生理学家定期对患者进行测试,协助医疗诊断和患者监测。这些测试包括12导心电图(ECG)、脑电图(EEG),神经传导测试和听力测试。¹⁸

引用

1。Piccolino m .动物电和电生理学的诞生:路易吉伽尔伐尼的遗产。大脑Res牛。1998年,46 (5):381 - 407。doi:10.1016 / s0361 - 9230 (98) 00026 - 4

2。何杰金氏病,赫胥黎A膜电流的定量描述及其应用在神经传导和激励。杂志。1952,117 (4):500 - 544。doi:10.1113 / jphysiol.1952.sp004764

3所示。动作电位的haus m . Hodgkin-Huxley理论。Nat >。2000;3,1165。doi:10.1038/81426

4所示。布洛克L,库姆斯J,艾克尔斯J .电位的记录运动神经元细胞内电极。杂志。1952,117 (4):431 - 460。doi:10.1113 / jphysiol.1952.sp004759

5。哈米尔O,马蒂,Neher E, Sakmann B, Sigworth f .膜片箝技术的提高目前高分辨率记录从细胞和胞外膜补丁。弗鲁格档案——欧元杂志。1981,391 (2):85 - 100。doi:10.1007 / bf00656997

6。Carmeliet e·伯恩斯坦的断流器Neher-Sakmann贴片电极。动作电位。杂志代表。2019年,7 (1):e13861。doi:10.14814 / phy2.13861

7所示。布兰科T,泽,马格努斯C et al。近乎完美的突触整合Na v 1.7下丘脑神经元调节体重。细胞。2016,165 (7):1749 - 1761。doi:10.1016 / j.cell.2016.05.019

8。Choudhury N,林利D,理查森et al。Kv3.1和Kv3.3子单元不同导致Kv3渠道和主要神经元动作电位复极化的听觉脑干。杂志。2020,598 (11):2199 - 2222。doi:10.1113 / jp279668

9。摩尔AK, Wehr m .指南在活的有机体内单元记录从optogenetically皮质抑制性中间神经元。J Vis实验。2014,(93):e51757。2014年11月7日。doi:10.3791/51757

10。格雷罗州,丹麦克郎Donnett詹,Csicsvari, J。,& Kovács, K. A. Tetrode recording from the hippocampus of behaving mice coupled with four-point-irradiation closed-loop optogenetics: a technique to study the contribution of hippocampal SWR events to learning.Eneuro。2018;5(4)doi:。10.1523 / eneuro.0087 - 18.2018

11。Quiroga中移动(2012)。斯派克排序。咕咕叫杂志,22(2)R45-R46。doi:10.1016 / j.cub.2011.11.005

12。小君J,斯坦梅茨N, Siegle J et al。完全集成硅探测器高密度记录的神经活动。自然。2017,551 (7679):232 - 236。doi:10.1038 / nature24636

13。斯坦梅茨N,科赫C,哈里斯K, Carandini m与Neuropixels探测大规模电生理学的挑战和机遇。当今一般。2018;50:92 - 100。doi:10.1016 / j.conb.2018.01.009

14。Kollo M, Racz R,汉娜米et al .一致:CMOS-hosted在活的有机体内为大规模可伸缩的神经微电极记录。前>。2020;14。doi:10.3389 / fnins.2020.00834

15。Stett, Egert U, Guenther Eet al。生物微电极阵列在药物发现中的应用和基础研究。肛门Bioanal化学。2003年;377年,486 - 495。doi:10.1007 / s00216 - 003 - 2149 - x

16。希尔CL,斯蒂芬斯GJ。介绍了膜片箝记录。达拉斯:M。,Bell D. (eds)膜片钳电生理。方法在分子生物学、2021年,2188年。胡玛纳,纽约,纽约。doi:10.1007 / 978 - 1 - 0716 - 0818 - 0 - _1

17所示。牧师BT,斯文森,麦克马纳斯OB。自动电生理学在药物发现。咕咕叫制药Des。2007;13 (23):2325 - 2337。doi:10.2174 / 138161207781368701

18岁。辛德。马克勒罗宾逊AJ, L。临床电生理学:电疗法和电生理学的测试。费城:Lippincott威廉姆斯和威尔金斯;2008年。国际标准图书编号13:9780781744843

关于作者

亚当·泽博士

亚当在活力四射实验室研究生进行了训练,他的研究集中在神经元在大脑的一个区域之间的通信的重要处理听觉环境。然后他搬到Heisler随后布兰科实验室在剑桥大学,英国医学研究委员会分子生物学实验室,分别为英国剑桥。他的博士后研究集中在下丘脑神经元沟通,特别是在驱动摄食行为的神经元。亚当是一个狂热的科学传播者和搬走了从实验室到全日制科学传播和营销促进世界各地的实验室里工作。

教授Ian活力四射