低温电子显微镜结构的见解如何加速和提高药物发现

确定一个目标的结构与其配体是指导开发新药物分子的关键。低温电子显微镜(低温电子显微镜)正在改变药物发现,帮助研究人员获得结构深入广泛的生物目标否则棘手。因为样品是flash在低温下冻结(低于-175°C),蛋白质可以检查他们的母语状态。此外,作为样品上面没有大小限制,完整,功能分子机器可以在3 d成像,包括一个或多个配体,揭示生物相关的机制。理解这样的机制将促进新疗法的发展。

对于药物发现低温电子显微镜结构观点是有用的

结构生物学已经在优化关键的新线索。x射线衍射(XRD)和核磁共振(NMR)是两个最广泛使用的技术测定大分子结构的高分辨率,但都局限与粒度、大分子的疏水性质,可用的样本数量。在低温电子显微镜,科学家没有这些限制,因此图像目标尚未解决。低温电子显微镜直接适用fragment-based药物发现(FBDD),因为它可以带来一个合适的详细级别分子片段之间的相互作用和他们的目标。例如,三个fragment-size配体的结构在低温电子显微镜获得的复杂与β-galactosidase分辨率大于2.3。¹一般来说,一项决议3或更好的需要确定的绑定模式fragment-sized配体结构,这样可以经常通过使用低温电子显微镜分辨率。晶体的一小部分商业有趣的目标绑定到治疗性抗体片段可以通过XRD分析,但由于低温电子显微镜不需要结晶的大小也没有限制,一个整体目标绑定到片段抗体(晶圆厂)可以成像。例如,抗体美罗华,已知治疗某些自身免疫性疾病和癌症,最近成像与目标CD20低温电子显微镜。²CD20-rituximab复杂的基于结构模型(图1)设计,和新的观察基于整个复杂的结构,揭示其机制,直到现在,还不清楚。解密的绑定模式受体的抗体是至关重要的发现和开发更有效的抗体类药物。

图1:CD20:利妥昔单抗低温电子显微镜的复杂。结构细节透露CD20之间的交互,B细胞的膜蛋白二聚体,两个晶圆厂(用紫色重链和轻链在粉红色)在glyco-diosgenin (GDN)胶束。
改编自信贷:模型²由汉斯Raaijmakers。

领导发现低温电子显微镜是一种独特的工具

由于低温电子显微镜三维分子结构是基于单粒子分析(SPA)在溶液中大分子的结晶不是必需的。因此,粒子被研究不需要在一个特定的缓冲区,可以方便地分析了本地条件,导致生物相关的结构。因此,本机复合物的结构可以在3 d成像。最困难的目标是G protein-coupled受体(GPCRs)。他们代表最大的受体家族在人类基因组中,涉及多种疾病,超过30%的销售药物靶向受体家族。在这种背景下,巨大的努力了数十年使用XRD和NMR确定GPCR结构,但只有截断模型能获得更稳定的复合物。2014年,低温电子显微镜分辨率革命标志着一个转折点 ³ 低温电子显微镜和x射线衍射和NMR形成互补的三个技巧。研究人员提示GPCRs采用低温电子显微镜和解决突出的结构(B类GPCR-G-protein复杂 ⁴ ;活跃、复杂、人力CGRP怎样Gs-protein受体结合 ⁵ ;腺苷受体负责工程heterotrimeric G蛋白耦合 ⁶ ;人类偏见agonist-bound GLP-1 receptor-Gs复杂 ⁷ )。最近,GPCR-G复杂的结构稳定使用抗体片段已经被阐明。 ⁸ 的能力mAb16抗体绑定Gα和Gβγ子单元,稳定GPCR-G复杂,即使在GTPγS的存在,是独一无二的。这种方法可以应用于其他g以最小的努力,促进GPCR /蛋白复合物的结构研究。

低温电子显微镜的范围并不局限于小的膜蛋白复合物。低温电子显微镜还允许研究人员解决全病毒结构和解剖与治疗。各种结构的构象可以提取在网上陶瓷样品的低温电子显微镜可以显示多个功能状态。最近健康暴发邀请我们看一些例子不同的构象之间的结构性差异可以解释由病毒感染细胞的机制。在过去的十年中,大约三分之一的诊断病例的病毒引起的呼吸道感染中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)是致命的。使用低温电子显微镜结构的见解,一个潜在的机制已经被建议的起始virus-cell膜融合。⁹这可概括的基于结构的方法使大跨膜突起蛋白(负责融合)的病毒抗原最优构象,这样可以有针对性的免疫系统。基于这一发现,强烈的中和抗体MERS-CoV目前正在发展。

最近,SARS-CoV-2冠状病毒(导致COVID-19疾病)被发现显示人类的亲和力受体血管紧张素转换酶2 (ACE2),类似于冠,2002年全球传播,允许病毒的融合与目标细胞,和它的感染。¹⁰迅速,附近的原子结构SARS-CoV-2飙升糖蛋白三聚物解决使用低温电子显微镜(图2),提供无与伦比的见解关于守恒和访问抗原表位来支持开发疫苗和病毒抑制剂条目。低温电子显微镜结果表明SARS-CoV-2峰值蛋白质显示一系列构象,从封闭到开放,支持假设的部分开启状态糖蛋白三是人类冠状病毒中发现高致病性。这不同于人类冠状病毒与普通感冒,在很大程度上封闭的糖蛋白三发现,并提出见解,并非由任何可视化技术低温电子显微镜。理解的后果的可变性的3 d支架目标将带来新的配体结合的理论机制,可能导致新药物分子的发现。

图2:3.2低温电子显微镜的结构在开放构型公开SARS-CoV-2 S糖蛋白。
信贷:模型改编自¹⁰由汉斯Raaijmakers。

低温电子显微镜和铅优化

通过提供结构性的见解,低温电子显微镜是至关重要的在支持发现铅和铅优化、再现性,质量和吞吐量的低温电子显微镜来支持片段筛选来说是足够的。 ¹ 方法简化的快速制备高质量的样品,导致低温电子显微镜分辨率的地图的设置,以2.6的3.1结构MDa酵母脂肪酸合酶(FAS)在一天内进行。 ¹¹ 这包括纯化的快速生产酵母FAS,低温电子显微镜标本玻璃化的高分辨率数据采集,数据收集本身。这个生产力与低温电子显微镜是不可接受的仅仅几年前。为每个高分子样品净化和准备是不同的:这一步尤为重要,对于了解分子机制配体在药物发现的药理作用。通过专注于精心准备的样品,而不是其成像所需的条件,研究人员设法保留了FAS phospho-pantetheine转移酶域,否则在结晶变性。 ¹¹ 使用此设置,研究人员可以专注于上游问题结构分析包括克隆、表达、纯化和蛋白质的严格监控完整。

低温电子显微镜片段筛选符合要求的能力方面的决议和吞吐量已经证明使用目标PKM2肿瘤学。¹小片段筛选68配体与PKM2在时间表中执行通常需要等实验。此外,提高吞吐量,片段的使用“鸡尾酒”可以成功地通过使用低温电子显微镜。¹最后,与强大的探测器和新的光学模式出现在现代低温电子显微镜显微镜,超过每小时400图像可以被收购,收购完整的数据集可以花费不到两小时。因此,在最佳使用和能力,低温电子显微镜可以完成400 -片段屏幕在不到一个月的时间。

总之,SPA,低温电子显微镜提供决议适用于领导发现,和它的吞吐量是足够高的支持引导优化。它产生的观察,研究人员并没有获得更加积极再保险,导致加速发现疗法和疫苗,帮助使世界更健康,更安全的地方。

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