“是如何改变蛋白质组学的游戏吗

科学家探索蛋白质组识别蛋白质,量化表达和分析修改。但蛋白质组覆盖和复杂性在增加。这对传统的分析带来了独特的挑战,这依赖于时间和劳动密集型的方法努力跟上高通量蛋白质组学的不断增长的需求。基于高分辨率质谱(MS)技术,然而,能够克服这些挑战,让他们选择的基本方法,转化和生物制药实验室。

这方面的最新进展,特别是微分离子迁移技术加上液相色谱(LC)和女士串联系统,使敏感、准确、高通量蛋白质组学分析在不牺牲性能。在这里,我们探讨蛋白质组学方法和覆盖可以受益于使用轨迹不对称波形离子迁移谱(饿)耦合到一个高分辨率的女士。

我们也研究不同模式的数据采集猎枪蛋白质组学(也称为自底向上的蛋白质组学),如视和data-independent模式,会影响蛋白质的数量确定,并与量化它们的信心。承诺的这些技术是使用一个案例研究演示了从paleoproteomics领域,这印证了他们的能力和潜力提供详细的蛋白质识别珍贵,稀有样本。

更有选择性,成效分析蛋白质

等常规方法检测和分析蛋白质,酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹,涉及大量的手工工作,因此是有限的效率和吞吐量。这些化验也并不总是足够的灵敏度来探测更丰富的蛋白质。科学家们依靠这些基于抗体的方法可能很难检测和量化蛋白质在微量水平高吞吐量的方式,限制的速度可以测试他们的假设。

猎枪蛋白质组学方法采用质带来急需的高通量蛋白质组分析的能力。在广泛使用的“自下而上”的蛋白质组学方法,复杂的蛋白质混合物分解成多肽,由色谱分离,质谱分析。

提高选择性和检测范围,女士可以结合救援人员使用。“是一个微分离子迁移技术,空间分离电离物种在气相强和弱电场的存在。放置在入口女士之前,只有离子与一个特定的移动值和稳定的飞行路径退出到女士被发现和测序。选择离子组遍历界面女士分析,二次直流潜力,补偿电压(CV),应用于内电极。改变离子的简历选择不同的组,并允许多个独特的前体被探测到,给予增加覆盖FAIMS-free方法。

联合救援人员和工作流女士带来了很多好处在常规分析和方法只涉及质。通过在线气相分离离子引入质谱仪之前,该方法增加蛋白质组报道没有任何额外的样品制备步骤,使其更有效率。饿了还提供纳米和毛细管流应用程序,帮助保护珍贵,size-limited样本。在实现方面,一些现代技术提供预先构建的方法与推荐模板参数,允许工作流无缝槽进入一个蛋白质组学实验室不需要任何额外的技术专长。

视数据采集(DDA):提高蛋白质组报道

蛋白质组学的目的是确定一个指定数量的蛋白质高的信心。这是是否实现取决于一个方法的方法来收集数据。经典的蛋白质组学研究获得的数据使用一个方法称为视数据采集(DDA),质谱仪分析LC分离组件的混合生产¹扫描。您,女士的高强度前体离子¹离子选择,支离破碎成更小的产品,进一步分析在第二阶段的串联女士(女士吗²)。女士的数据²然后被收购后的数据库搜索,以确定多肽。

银两前体的随机性质选择意味着检测肽的比例得到分散,通常80%的碎片离子之间共享的所有运行时,导致可怜的再现性。只有选择前体支离破碎,肽的采样,和一些蛋白质组信息丢失。这是通常被称为缺失值问题,并限制在大量样本的定量精度。

全面完整的人类蛋白质组的分析从一个单细胞类型,~ 584000独特的肽序列使用MS-based猎枪从分析了海拉细胞蛋白质组学(1)提高探测极限的DDA方法和最大化确定蛋白质的数量,研究者使用几个示例加载多个短但是梯度。这种多重射击策略增加了动态范围和蛋白质组报道单发方法相比,在保持高信心识别的错误发现率为1%蛋白质水平。

研究人员还试着用“银两,运行一个简历梯度允许不同组的离子进入质谱仪。这使他们能够识别蛋白质在给定的简历超过30%之前FAIMS-free工作流。

Data-independent收购(DIA):全面和公正的

data-independent收购(DIA) * *,所有分析物在一个预定义的窗口是支离破碎,随后分析了MS²扫描。DIA方法每个肽片段在样例——不只是选择的前兆,您——提供更高的再现性。在分裂过程中,以上肽产生碎片离子信号噪声会持续记录在每次运行,显著减少丢失的数量值。这种无偏蛋白质分析方法使得DIA蛋白质组发现有潜力的技术分析。

DIA获得女士²光谱以类似的方式,允许它识别比银两肽前体,而不是获得女士²按顺序光谱。由Jesper奥尔森教授的研究小组在哥本哈根大学的猎枪的性能相比蛋白质组学利用DIA和DDA方法(2)使用相同的质²梯度,DIA经常确认数量的两倍以上肽与英国相比,同时提供一个更大的动态范围。

加上饿,DIA带给两全其美蛋白质组学分析:更高的再现性和更大的蛋白质组的报道。奥尔森在一个实验的实验室测试的敏感性不同的方法在蛋白质组分析中,执行一系列稀释,浓度逐渐增加装载样品进行了分析。DIA,再加上饿,始终产生更高的数字量化蛋白质单独谈判或DIA相比,即使加载样品的数量很低。例如,在5 ng加载示例,而DDA和DIA确定26日和547蛋白质分别DIA救援人员发现1074蛋白质,使其成为最敏感的方法相比。

案例研究:蛋白质组学分析的43000岁高龄的长毛猛犸象骨骼

paleoproteomics领域,涉及罕见化石样本研究物种进化,需要高度敏感的蛋白质组学。蛋白质是保存在化石远超过DNA和作为古老的生物标记,提供无价的进化关系和分子系统发育推断的信息。历史骨样品不适合DNA测序,因此受到高分辨率串联女士(如方法基于LC-FAIMS-Orbitrap MS)来识别古老的蛋白质。

使用高灵敏度、高分辨率串联女士研究协作包括自然历史博物馆在丹麦和诺和诺德基金会蛋白质研究中心执行鸟枪测序古代蛋白质仍从43000岁的猛犸象骨骼保存在西伯利亚永久冻土层(3)。

研究小组发现126独特的蛋白质猛犸骨骼,其中90%还没有被发现通过MS-sequencing从一个古老的骨头。蛋白质概要显示细胞外基质(ECM)的优势相关蛋白质(49%)和血浆蛋白(21%),其余由膜和胞内蛋白质、胶原蛋白、角蛋白。

由于分类位置的序列变异,“技术带来了深蛋白质组覆盖所需的项目,说明如何先进的高通量蛋白质组学平台在进化生物学提供新的视角。

蛋白质组学为基本和转化研究

蛋白质组学实验室正面临日益增加的需求,这些可以通过滚动饿的选择性和高分辨率的女士为一个健壮的工作流。是否最终的应用程序是探索性的,如paleoproteomics,或通过识别转化患者样本的临床相关的生物标记物,这些先进的MS-based方法带来的高通量功能支持快速筛查数以百计的样本,同时提高量化精度和增加蛋白质组报道。

引用

1。一个优化猎枪策略的快速生成全面的人类蛋白质组https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5493283/

2。绩效评估的Q Exactive HF-X猎枪蛋白质组学https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.7b00602

3所示。更新世猛犸股骨的蛋白质组学分析揭示了一百多个古代骨蛋白质https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/pr200721u

* *DIA方法目前尚未在美利坚合众国