离子对色谱- IPC如何工作,优点,局限性和应用
带电分析物的色谱分析通常具有挑战性,因为它们不能有效地保留在常用的反相色谱柱和死体洗脱液上。在极性或水相固定的色谱柱上,由于过多的保留,峰的形状可能很差。使用带电固定相分离相反带电离子的离子交换柱价格昂贵,适用于小范围的分析物,分离效率有限。离子对色谱(IPC)是极性或离子物种色谱的合适替代品。
什么是离子对色谱法?
IPC是一种离子色谱法这是被使用的分离:分离亲水或带电的分析物列使用逆相或“中性”不带电荷的固定相。它包括通过与添加到流动相的离子配对试剂的相互作用来修改带电分析物的极性。这些试剂分子携带的电荷与被分析物离子的电荷相反,它们能够形成静电键。在分析物和试剂离子之间形成的对表现为中性的疏水基团,可以在C18或C8色谱柱上分离。IPC用于极性有机酸、碱、两性离子以及无机离子的分离。
离子配对试剂也称为离子配对添加剂或杂离子。由于这些分子具有极性头基和疏水碳氢化合物链,因此它们类似于肥皂(图1)。因此,当这种技术被引入时,被称为“肥皂色谱”Göran Schill在1973年。1,2它也被称为离子相互作用色谱,因为试剂离子与固定相相互作用,以调节样品中存在的离子的保留。
图1: 肥皂的结构。
离子对反相色谱与其他类型的离子色谱有何不同?
离子色谱(IC)广义上是指离子的分离,包括三种不同的机制,即离子交换、离子排斥和离子配对。当分析物离子和洗脱物离子在固定相上电荷相反的位置竞争性相互作用导致分离时(图2),称为色谱类型离子交换色谱法(IEX).
图2: IEX分离机制。
未解离的,部分解离的和完全解离的分析物的混合物可以被分离离子排除色谱法(IEC),它也使用带电固定相(图3)。流动相积聚在固定相的孔隙表面和内部,导致“闭塞相”的形成。中性分析物强烈保留在闭塞相和洗脱最后从柱。部分解离的分析物与吸附流动相的相互作用略小,较早洗脱。完全解离和带电的分析物,被固定相的类似带电离子排斥,唐南膜,先洗脱,共在柱空体积。
图3: IEC中的分离机制。
离子对反相色谱法通过向流动相中添加离子配对试剂,在非极性“反相”柱上进行。例如,三氟乙酸用于与带正电荷的多肽配对,而三烷基胺用于与阴离子配对,如羧酸盐或寡核苷酸。
流动相离子色谱(MPIC)是一个术语,通常用于IPC分离小无机离子,然后用抑制电导率测量.这种技术适用于带局部电荷的分子的分析。
离子对色谱是如何工作的?离子对效应的作用是什么?
将几微升样品溶液注入反相色谱柱中。当含有离子配对试剂的流动相流过色谱柱时,分析物离子与相反带电的试剂离子相互作用并形成中性络合物,可以在非极性固定相上分离。分析物的分离由离子配对试剂、有机改进剂和添加到流动相中的任何盐控制。
紫外线(UV)荧光光谱法是IPC最常用的检测技术。其他技术的使用,如质谱法而且电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)3.也有报道。电导率测量是一种成熟的IC检测无机离子的方法,但较少用于IPC。4
图4: 离子对反相色谱仪器。
保留机制
已经提出了不同的模型来解释IPC中观察到的分离机制。5在离子配对模型,也叫划分模型,分析物离子与离子配对试剂离子之间的相互作用被认为发生在流动相中。分析物离子与反离子形成非极性部分,可吸附在疏水固定相上。离子对络合物随后通过增加流动相中的有机改进剂浓度来洗脱(图5)。
图5: 离子配对模型 IPC分离,显示离子对络合物在流动相中形成的
的离子交换模型,也叫吸附模型,涉及离子配对试剂分子的亲脂烷基链在固定相上的吸附。被吸附分子的自由极性头基团对带相反电荷的分析物离子起到伪离子交换剂的作用(图6)。
图6: IPC分离的离子交换模型,显示了被分析物离子和吸附在固定相上的离子配对试剂离子之间的相互作用。
在离子相互作用模型,也叫静电模型,当柱与含有离子对偶剂的流动相平衡时,被认为形成了电双层。这些部分的非极性碳氢链与柱结合。极性头基团形成固定电荷层,而离子配对试剂的反离子在流动相中形成相反的电荷层。分析物离子经历静电吸引静止电荷,并能够穿透双层。库仑相互作用在分析物分子和“带电”层之间导致固定相表面电荷的明显减少。因此,离子配对剂的分子被吸附在固定相的表面以恢复电荷。总的来说,这可以被认为是吸附两个相反的电荷-分析物和离子配对剂-在固定相上。
图7:IPC分离的离子相互作用模型,显示了分析物离子、离子配对试剂离子和固定相之间的动态相互作用。A)离子配对试剂与固定相结合。B)分析物离子穿透双层。C)被分析物离子与极性头基团结合。D)一种新的离子配对试剂分子与固定相结合。
影响留存率的因素
在IPC中,可以修改几个参数来实现所需的分离。让我们考虑一些影响分析物保留的变量。
- 离子对偶剂浓度-流动相中高浓度的离子配对试剂导致分析物与色谱柱的过度强结合,使其难以洗脱。另一方面,低浓度会导致分析物与色谱柱的结合不足。因此,优化流动相离子配对试剂浓度对IPC至关重要。离子配对试剂对中性分子的保留没有影响,而它们减少了带电相似的分析物的保留,增加了带电相反的分析物的保留。一般情况下,它们在流动相中的浓度保持在0.5 ~ 20 mM之间。
- 有机改良剂的选择与浓度-将甲醇和乙腈等化合物添加到流动相中,以调整化合物的保留,因为这些修饰剂与离子配对试剂和分析物竞争柱上的活性位点。有机修饰剂影响中性分子的保留以及离子配对试剂的吸附,这反过来又影响带电分析物的保留。它们还降低了流动相的极性,并有助于溶解疏水离子配对试剂。
- 列平衡-色谱柱必须与离子配对试剂充分平衡,以确保其吸附在固定相上。
- 列温度-在较高的柱温下,流动相的粘度降低,从而导致更快的分离。
- 流动相pH值-必须仔细控制流动相的pH值,以确保a)分析物和离子对偶剂的电离,以及b)它们在色谱柱上的最佳相互作用和保留。在使用电导率检测时,pH值调整也很重要。
- 流动相添加剂-无机离子,如碳酸盐,已被证明可以减少分析物在IPC中的保留。
离子对效应作用
当电解质被添加到溶剂中时,它们解离成它们的组成离子并被溶剂分子包围。但随着溶剂极性的降低,离子的溶剂化作用降低,由于静电吸引,它们之间的相互作用增加。随着离子尺寸的增加,电荷密度降低,这也导致更少的溶剂化和更大的相互作用与相反的带电离子。离子上的电荷越大,带相反电荷的离子之间的库伦引力就越强。
离子配对试剂具有较长的烷基链或芳基,不像具有高电荷密度的小离子那样溶剂化。因此,它们可以吸引并与带相反电荷的分析物离子配对。此外,当离子对试剂吸附在非极性固定相上时,它们的溶剂化进一步减少。这使它们能够形成"亲密的”或“亲密的”离子对与分析物分子。这些离子对之间没有任何溶剂分子。分析物和试剂离子上的电荷越大,它们之间的键就越强。
为您的离子对选择离子对试剂
离子配对试剂的选择可能是使用IPC时最重要的参数。试剂类型、浓度以及与流动相和检测器的相容性对分析物的有效分离都起着重要作用。在为所研究的样品选择离子配对试剂时,必须考虑以下因素。
- 铵或四烷基铵离子(R4N+)用于与阴离子配对。Alkylsulfates (ROSO2O-)和烷基磺酸盐(RSO3.-)通常用作离子对偶剂,用于分析阳离子。
- 构成试剂亲脂部分的烷基、芳基或烷基取代芳基的链长影响分离,必须针对所研究的分析物进行优化。
- 亲水化合物,如氟化有机酸,如三氟乙酸(TFA)、氢氧化铵、氢氧化钠、硼酸、盐酸和高氯酸,被用作疏水阴离子的离子对试剂。
- 试剂必须能溶于有机改进剂。
离子配对的优点、局限性和常见问题
虽然离子对色谱比其他技术(如IEX和正常相色谱)具有一定的优势,但它也有局限性(表1)。在选择这种分离模式之前,必须仔细考虑这些优点和缺点。
表1:IPC的优势和局限性。
的优势 |
限制 |
通过选择合适的离子配对试剂并调整其浓度,可以实现对其他技术难以分离的极性、非极性和离子化合物的混合物的分析 |
离子配对试剂吸附到固定相表面需要很长的平衡时间 |
IPC可以在大多数实验室常用的C18或C8色谱柱上进行 |
梯度分析对于IPC来说可能是困难的,因为流动相组成的变化可能导致较长的柱平衡 |
正离子和阴离子都可以用同一根色谱柱分离 |
离子配对试剂不应吸收进行紫外或荧光检测的波长。在流动相中存在吸光试剂可引起虚峰和负峰,这是由于与含有离子配对试剂的流动相相比,分析物的吸光度较低 |
离子配对试剂有助于改善保留,峰形状和分辨率 |
常用的挥发性有限的离子对偶剂与质谱仪的兼容性有限。TFA用作修饰剂时,会导致质谱仪中的信号抑制 |
较低的运行时间和检测限可以获得存在的离子配对试剂 |
当使用IPC试剂时,可能必须使用专用色谱柱 |
离子对色谱法的应用
IPC已应用于各种分析物的分析,从环境样品、药品和食品到生物样品和金属。
环境分析
- 阳离子表面活性剂,如十六烷基三甲基铵离子和阴离子表面活性剂,如线性烷基苯磺酸盐,用于制造洗涤剂,织物柔软剂和清洁剂以及化妆品。采用离子对法同时测定了环境水样中的阳离子和阴离子洗涤剂高效液相色谱法以二正丁胺离子为离子对剂,电喷雾电离质谱法进行检测。6
- 离子液体曾经被认为是有机溶剂的安全替代品,但事实证明,它对各种植物、动物和微生物都是有毒的。因此,在环境样品中检测它们的灵敏方法已经发展起来。1 -羟乙基- 3 -甲基咪唑的基线分离[HOEtMIm]+)和1 -羟丙基- 3 -甲基咪唑([HOPrMIm]+采用反相C18色谱柱,辛磺酸钠作为离子配对试剂,获得阳离子。该方法已应用于羟基功能化咪唑的检测离子液体河水样品中的阳离子。7
药物和食品分析
- 为了研究药物的安全性、有效性和稳定性,它们通常在生物基质中与其代谢产物一起进行分析。反义寡核苷酸药物及其代谢产物采用离子对反相色谱结合质谱检测进行分析。8
- 一个简单的、stability-indicating采用高效液相色谱法,以正庚烷磺酸为离子对剂,在220 nm处进行紫外检测,测定了抗精神病药物阿塞那平。该方法可用于阿西那平片剂中低浓度阿西那平的含量测定。9
- 加工食品加碘形式为碘离子和碘酸离子。需要进行质量控制测试,以确保这些盐在消费品中达到所需的水平。采用反相高效液相色谱法,以1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体和咪唑离子液体为离子对试剂,利用紫外吸收发色剂,对药品和饮料中的这些离子进行了分离和检测。10
- 作为一个质量控制采用离子对色谱电位法测定了新鲜番茄、番茄碎罐头和番茄浆中生物胺的含量。11
- 氨基多羧酸(APCA)被用作螯合剂在药品、化妆品和食品产品中去除金属污染物并增加这些产品的保质期。用离子对高效液相色谱法测定小分子药物中apca的存在,如乙二胺四乙酸(EDTA),通过与铜络合。另一种APCA二乙三胺五乙酸(DTPA)在单克隆抗体中与铁络合,以四丁基铵离子作为离子配对试剂。12
生物分析
- 来了解生物作用以四正丁基溴化铵为离子配对试剂,分离分析了真黑素和褐黑素氧化得到的羧酸。13
- 进行氨基酸缩合反应研究生命的起源.需要简单的分析方法来量化这些反应的产物。Campbell等人开发了一种离子对高效液相色谱法来分析甘氨酸及其低聚物(Glyn),最多14个残基长。14
金属分析
- 螯合物采用离子对高效液相色谱法在15分钟内测定了2-吡啶间苯二酚(PAR)对Co(II)、Cr(III)和Ni(II) 3种重金属的含量。15
- 放射性镏,陆177,用于研究,和放射性药物的制造.它是由镱、Yb辐照产生177,或其化合物,然后从母体Yb分子分离。离子对反相高效液相色谱法纯化了Lu177从10毫克中子辐照YB中2O2使用含有极性固定相如丁腈或烷基硅氧烷的硅胶柱进行目标.16
- 硫代硫酸盐用于提取黄金硫代硫酸盐及其降解物存在于浸出液中,金属回收后,估计以确定该工艺的效率。采用抑制电导率反相IPC法测定了不同金萃取液中硫酸盐、硫代硫酸盐和聚硫代酸盐的含量。17
结论
几种色谱模式,如亲水相互作用色谱(HILIC)和IEX,以及不同类型的固定相,如离子交换或极性,已用于带电分子和可极化分子的分离。然而,由于IPC的简单性和可定制性,它继续用于他们的分析。离子配对试剂的选择、离子配对试剂的浓度、有机改良剂和流动相添加剂等参数都可以通过优化来实现所需的分离。
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