结构生物学的关键技术,它们的优势和局限性
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结构生物学是一个科学领域,使用各种技术来确定生物分子的3D结构,如蛋白质,核酸及其复合物。这些技术允许研究人员以不同的分辨率阐明分子结构,从原子到超分子水平。此外,结构生物学侧重于研究生物分子的相互作用和动力学,即分子如何随时间相互作用和变化。这对于理解生物分子的功能及其在健康和疾病中的作用至关重要。
结构生物学使用什么技术?
结构生物学的主要技术包括x射线晶体学、核磁共振(NMR)波谱学和低温电子显微镜(cro - em),这些技术通常与交联质谱(XL-MS)、小角度x射线散射(SAXS)、中子衍射、蛋白质水解、圆二色(CD)和电子顺磁共振波谱(EPR)等方法互补。计算方法和技术的进步也在结构生物学中发挥了重要作用,为分析、解释和整合来自不同技术的数据提供了新的方法。这使研究人员能够更深入地了解生物分子及其相互作用、动力学和与生物过程的关系。让我们来考虑这些关键技术,它们在结构生物学中的作用以及它们的优点和局限性。
低温EM
低温电镜是一种电子显微镜在分析之前对样品进行低温处理的技术。一般来说,它被应用于蛋白质的结构研究,特别是那些不能用其他技术研究的蛋白质,如大的蛋白质复合物,膜蛋白或不形成晶体的蛋白质。由于电子束通过样品的相互作用,该技术可以以接近原子的分辨率(与x射线晶体学或核磁共振光谱学相当)获得图像。低温处理有利于保存样品的原始分子结构。借助于仪器和软件的最新发展,可以自动处理样品(例如蛋白质)的大量图像,并以接近原子的分辨率重建其3D结构(图1)。1,2,3.,4
低温电镜的局限性在于,样品制备过程非常艰苦,一些蛋白质复合物会在制备过程中被破坏。Cryo-EM仪器及其维护是昂贵的,产生的大量数据需要大量的计算工作来处理。最后,可以使用冷冻电镜分析的蛋白质的大小有限制,因为在一定大小以下,所获得的图像显示非常低的信噪比。1,2,3.,4
图1: 蛋白质结构冷冻电镜分析的工作流程。资料来源:科技网188金宝搏备用络。
X射线晶体学
这种技术是基于事实的晶体样品能够引起入射x射线束的衍射,产生一种特征图案,可以用来推断原子水平上晶体的结构。结晶样品用x射线束以不同的入射角度照射。由样品有序原子结构引起的x射线散射产生了由传感器记录的特征模式。通过信息学处理,在不同入射角获得的整套模式可以推断样品的电子密度,由此可以建立原子尺度的结构模型(图2)。5,6,7,8,9
x射线晶体学是分辨率最高的结构生物学技术之一。与其他结构生物学方法相比,它具有高度自动化和相对便宜的优点。数据采集后结构解析处理速度较快。理论上,可以用x射线晶体学分析的分子没有尺寸限制,但样品结晶的容易程度存在限制。大而复杂的分子通常很难结晶,特别是当它们包含动态区域时,例如柔性区域或附着的碳水化合物。即使有可能生成复杂分子的晶体,有时也很难以良好的分辨率阐明它们的结构。最后,结晶过程会以某种方式影响分子结构,这意味着最终阐明的结构可能与生理条件下发现的原始结构完全不同。5,6,7,8,9,10
图2: x射线晶体学测定蛋白质结构的步骤。资料来源:科技网188金宝搏备用络。
由于x射线辐射是高能量的,在x射线晶体学中使用的样品晶体必须在测量之前用液氮快速冷冻,以最大限度地减少样品损伤并减少热运动产生的噪声。在过去的十年中,x射线晶体学的一种变体被开发出来——串行飞秒晶体学(SFX)——它否定了这种需要。SFX是基于x射线辐射源的使用,称为x射线自由电子激光器(XFEL),它能够产生持续时间非常短的强烈x射线脉冲(fs = 10)-15年s).这些脉冲是如此强大,以至于它们完全破坏了样品晶体。因此,有必要对数量非常高的随机取向晶体(> 10万)进行连续分析,以阐明样品的分子结构。为了达到这一目的,将含有样品小晶体的液体喷射注入一个腔室,并由XFEL照射。由于脉冲速度极快,可以在很短的时间内分析数千个晶体(图3)。这种方法的优点是晶体比传统x射线晶体学中使用的晶体要小得多,并且在测量之前不需要快速冷冻,因此可以在室温下进行实验。此外,SFX还能提供分子动力学方面的信息。11,12,13,14,15
在药物发现的背景下,蛋白质是新型候选药物的主要靶点。因此,阐明越来越多蛋白质的结构已成为结构生物学领域的主要兴趣。从蛋白质样品中快速获得晶体的方法的进步导致了所谓的高通量(HT)晶体学的发展。这种方法基于自动化系统、小型化和工艺集成的使用,以获得大量可在短时间内分析的结晶样品,以非常有效的方式生成大量数据集。该技术不仅可以快速优化结晶条件,而且还有助于对靶向蛋白质的候选药物进行大规模筛选。17,18,19,20.,21,22
核磁共振光谱学
核磁共振光谱学利用一种物理现象,其中原子核被射频照射并达到激发态。当原子核恢复其基本能量状态时,会发出辐射,并被探测器收集到(图4)。探测到辐射的频率取决于原子核的化学环境,其强度与同类原子核的数量有关。有多种类型的核磁共振实验,提供关于不同化学元素的信息(例如,1H,2H,13C和15N),即它们的连通性或空间邻近性。23
- 大分子的结构说明
- 大分子动力学研究
- 生物分子间相互作用机制的表征
对于结构说明,通过核磁共振光谱获得的数据允许原子之间的距离和键角计算。这些距离和角度值被用作约束来执行结构的计算计算。在分子动力学的情况下,一些核磁共振实验被用来分析结构柔韧性和估计弛豫参数。最后,有许多实验核磁共振方法来检测分子之间的相互作用并识别所涉及的原子,这使得理解相互作用机制成为可能,这在药物发现领域非常相关。23,24,25,26,27
核磁共振波谱在接近天然条件下的生物分子研究中特别有用,因为它通常在水溶液中进行。这是一种非常通用的,非破坏性的技术,由于大量不同的实验可用于分析不同的分子方面。核磁共振波谱与低温电子显微镜和x射线晶体学一起,是生物分子结构测定最常用的方法之一。24,25,26,27
然而,核磁共振波谱有其局限性。首先,仪器和维护相当昂贵。其次,它的灵敏度很低,因为大多数可以分析的原子核对应的同位素自然发生率很低。这意味着许多生物分子样本必须在某些同位素(如13C或15N),这是一个昂贵的过程。此外,溶液核磁共振光谱分析的分子大小也有限制,因为大分子会影响样品在水溶液中的均匀性,这是一个临界点。在这些情况下,固态核磁共振波谱可以是一种替代方案。23,24,25,26,27
图4: 蛋白质结构测定的核磁共振波谱工作流程。资料来源:科技网188金宝搏备用络。
交联质谱(XL-MS)
XL-MS是一种质谱分析(质谱)用交联剂处理生物样品(分离的蛋白质、大分子复合物、细胞器、细胞甚至组织或器官)的分析。然后,样品进行酶促蛋白水解,随后用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS).28,29,30.,31, ,32,33,34
用交联剂处理会在样品中相互作用的蛋白质或其他分子的不同区域之间产生许多附着。当样品进行蛋白水解时,样品中的蛋白质会裂解,但交联区域会保持附着。由于交联的长度是已知的,对结果数据的计算分析将建立蛋白质之间的距离限制,并确定哪些蛋白质相互作用。把所有这些数据放在一起,就可以描述样本中存在的蛋白质相互作用网络(图5)。28,29,30.,31,32,33,34
XL-MS是一种高灵敏度的技术,能够检测和识别非常少量的分析物(~10-15年摩尔)。与其他技术相反,所研究分子的大小或复杂性没有限制,因为质谱分析是在蛋白质片段上进行的。由于交联反应可以在生理条件下进行,结果将反映自然条件。这项技术的主要贡献是它能够生成关于蛋白质相互作用网络的高通量信息,特别是在具有挑战性的系统中,如内在无序蛋白(IDPs)。28日,29,30.,31,32,33,34