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LC-MS -什么是LC-MS, LC-MS分析和LC-MS/MS


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从药品和食品到体液和土壤,分析实验室越来越需要精确测量微克和亚微克目标,有时在复杂矩阵中。虽然这本身并不是一项简单的任务,但在确保数据质量的同时,尽可能快地分析数百个样本的潜在需求增加了额外的挑战。

耦合的液相色谱法(信用证)质谱分析(质谱)为分析科学家提供了一个强大的工具来满足这些严格的要求。由于其通用性和效率,液相色谱-质谱(LC-MS)仪器已成为许多现代分析实验室所需要的。


什么是LC-MS?


LC-MS是一种分析技术,涉及目标化合物(或分析物)的物理分离,然后进行基于质量的检测。虽然
相对较新的它的灵敏度、选择性和准确性使其成为检测从药物代谢物、农药和食品掺假到天然产品提取物等多种分析物的微克甚至纳克量的首选技术。


LC-MS是如何工作的?


LC分离


信用证
将液体样品或固体样品的溶液中的分析物进行物理分离。将几微升的样品溶液注入流动的溶剂中,称为流动相。而最优注射量取决于实验条件,可以准确地注射少至0.1µL到多达100µL的样品autosampler。1流动相被连续泵送通过一个柱(一个不锈钢管),通常填充有二氧化硅颗粒,表面包裹着另一种液体,即固定相。当样品溶液-流动相混合物到达色谱柱时,其组分将根据其化学组成或物理性质与固定相(留在色谱柱中)发生不同的相互作用。根据分析物与固定相相互作用的机理,LC分离分为不同的模式,如:

-分割色谱法
-基于分析物在固定相中的溶解度和疏水性与在流动相中的不同。

-离子交换色谱法
-根据离子电荷分离被分析物。

-凝胶排阻层析法
-利用分析物分子大小的差异来分离它们。

-亲和色谱法
-根据分析物与固定相结合的能力分离分析物。


有些分析物与固定相的相互作用比其他的更强,导致它们在通过色谱柱时分离。与固定相相互作用最小的分析物首先从色谱柱中析出。当流动相继续流过色谱柱时,剩余的分析物依次被冲洗出来,相互作用最强的分析物最后出现。特定分析物在色谱柱中停留的时间是该分析物的特征,称为其保留时间(RT)。


LC检测


从色谱柱流出的流动相(洗脱液)通过一个检测器,该检测器对其中的分析物的某种物理或化学性质(如折射率或光吸收)做出“反应”。该响应被捕获为信号或“峰”,其强度(峰面积或峰高)对应于样品中存在的成分的量。检测器“看到”被分析物的时间是它的RT。样品中化合物的身份可以通过将其RT与已知化合物的RT进行比较来确认。虽然这不是一种准确的化合物鉴定方法,但当知道样品的一些信息时,它会有所帮助先天的


采用质谱进行LC检测


虽然种类繁多
探测器不同的技术和灵敏度已与LC相结合,以分析不同的样品类型质谱计已经成为一种选择性的、灵敏的、通用的探测器。


与其他检测器不同,携带分离分析物的LC洗脱液不允许流入质谱仪。LC系统在环境压力下工作,质谱仪在真空下工作,两者通过接口耦合。当柱状洗脱液流入界面时,溶剂通过加热蒸发,分析物分子蒸发电离.这是至关重要的一步,因为质谱仪只能检测和测量气相离子。


由于分析物离子是在大气压下在界面中产生的,因此该过程称为大气压电离(API),该界面称为API源。电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)是LC-MS分析中最常用的源。


被分析的离子被吸入
质谱计它们受到电场和/或磁场的影响。通过改变施加的电场,离子的飞行路径被改变,从而保证了它们的稳定性分离根据它们的质量电荷比(m/z)值相互之间的。分离后的离子可以通过多种方法收集和检测质量检测器2其中最常见的是电子倍增器。当分离的离子撞击电子倍增器表面时,二级电子被释放出来。这些次级电子通过一系列节点级联而成倍增加。测量由次级电子流动产生的放大电流,并将其与质谱仪中任意给定时刻的离子浓度相关联(图1)。

LC-MS设置示例示意图,显示流动相和分析物从进入系统,通过混合、分离和MS分析到检测的路径。

图1:
LC-MS设置示例原理图。资料来源:Cwszot, Dagui1929, CasJu和YassineMrabet,在知识共享CC0 1.0通用公共领域奉献许可证


绘制LC-MS数据


在LC-MS分析样品时测量的离子丰度绘制为总离子色谱图(TIC)。该图显示了分析物离子相对于其rt的峰值强度。此外,色谱图中的每个点都与质谱相关联。质谱描述了离子丰度与测量的m/z值的关系(图2)。

LC-MS分析输出图示例。第一个平面表示LC分离得到的保留时间,第二个平面表示质荷比,第三个平面表示强度。

图2:
LC-MS分析输出图示例。来源:Daniel Norena-Caro,在 知识共享CC0 1.0通用公共领域奉献许可证。


化合物的质谱不仅提供了母体化合物的质量信息(从其离子的m/z值),而且还有助于从相对丰度来阐明化合物的结构
同位素质量峰.分析物峰的面积用于其定量。


质谱仪可以在两种模式下工作,a)扫描和b)选择离子监测(SIM)。在扫描模式下,设置为在指定时间内检测从低m/z到高m/z值的所有离子。该模式用于分析未知样品或样品中存在的离子没有可用信息时。在SIM模式下工作时,将质谱仪设置为测量特定的m/z值。这是准确定量样品中已知化合物的首选操作模式。


液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)


通过耦合两台串联操作的质量分析仪,可以进一步提高样品鉴定和准确定量。三重四极杆质谱仪(QQQ或TQMS)和四极杆飞行时间(QTOF)是最常用的串联质谱仪。这些配置为样品分析提供了几种可能性。


TQMS由两台四极杆质量分析仪(Q1和问3.),由碰撞单元(q/ q)分隔2)。尽管问1和问3.作为质量分析仪来扫描质量范围或监测特定m/z值的离子,碰撞池用于将Q1通过使它们与中性气体(如氩气、氦气或氮气)发生高能碰撞。操作a是可能的
全面质量管理四种不同的模式5(图3),即:

-前体离子扫描
-第一个四极杆(Q1)在一个质量范围内进行扫描,以选择特定产物离子的前体(m/z值),然后在最后一个四极杆(Q)中进行监测3.)。

-产品离子扫描
——问1设置为仅向碰撞单元传输预先定义的前体(m/z),而Q3.在一个质量范围内扫描,以识别在实验条件下获得的碎片。

-中性损失(NL)
-都是Q1和问3.扫描以识别所有前体,这些前体通过从所有前体中失去相同的中性(不带电)物质而产生产物。Q的扫描范围3.被NL值所抵消。

-选择性反应监测(SRM)
-都是Q1和问3.设置为监测前体和产物离子的特定m/z值。该方法具有特异性和敏感性,是复方定量的首选方法。TQMS可用于监控相同或不同分析物的多个前体到产品的转变。


TQMS在Q1, Q2和Q3显示电离和选择的操作模式,用于产物离子扫描,前体离子扫描,中性损失扫描和选择的反应监测。

图3:
全面质量管理体系的运作方式。


碎裂取决于分子的结构和实验条件,如气体压力和碰撞能量。因此,在特定的反应条件下,利用碎片图与化合物RT及其准确的质量值进行鉴别。此外,对特定片段离子的监测有助于提高检测的灵敏度,从而能够定量更少量的目标化合物。


QTOF质谱仪有一个四极杆质谱仪和一个由碰撞单元分开的飞行时间质谱仪。四极杆既可以用来传输离子,也可以用来分离一个特定的前体离子,然后在碰撞细胞中破碎。一小部分离子首先由调制器脉冲进入TOF分析仪,随后通过施加高压加速进入高真空无场区。具有不同m/z值的离子在飞行管中以不同的速度运动,并且彼此分离。TOF质量分析仪提供高质量分辨率,同时能够快速扫描大质量范围。


质分析


LC-MS已广泛应用于各种基质中的小分子和大分子蛋白质的分析。这项技术的一些应用例子如下:

-活性药物成分中基因毒性杂质的定量4

- 检测12种模型化合物,这些模型化合物代表了呼出气体中特定类别的兴奋剂,如合成代谢剂和模拟物5

-量化生物体液中的药物代谢物

-检测食品原料中的掺假物质6还有膳食补充剂7

-决定制革厂沉积物中的烷基酚聚氧乙烯酯8

-游泳池和河水样本中个人护理产品的定量分析9

-细菌细胞中核苷酸及其衍生物的定量10

-量化蛋白质组

-作为一种快速测定SARS-CoV-2检测11


该技术也被用于分析饮用水石油化工产品土壤生物制药食物,并检测全氟和多氟烷基物质(PFAS)农药残留。

LC-MS的优势和局限性


的优势


LC-MS适用于极性和非极性化合物的分析
热不稳定的分子。这些化合物的范围从m/z值< 1000 Da的低分子质量分析物,到m/z值为10万Da的非常高的分子质量蛋白质。化合物的“软电离”主要给出分子离子和同位素峰,这有助于测定分析物的准确质量和推定公式。当与破碎光谱相结合时,就有可能阐明被分析物的结构。


虽然LC-MS分析通常需要几毫克的纯化合物,但只要1毫克就足够了。通过在SIM或SRM模式下操作质谱,可以实现ng/mL甚至pg/mL范围内的检测限。由于在SRM模式下仅监测特定离子,因此即使对存在于复杂基质中的分析物也实现了选择性。


限制


LC-MS仪器的拥有、操作和维护都很昂贵。操作仪器和分析数据需要专业知识。与其他分析技术相比,样品吞吐量适中。
由于获得的光谱取决于实验条件,包括仪器类型,通过与参考光谱的比较来鉴定化合物的范围是有限的。由于质谱仪是一种破坏性检测器,在处理可能不易获得或无法大量获得的样品时必须小心。作为一种基于实验室而非现场的技术,用LC-MS分析不稳定或反应性样品具有挑战性。


由于只能将液体样品注入柱中,因此固体样品必须溶解在合适的溶剂中,或者必须从样品中提取分析物。采用液-液萃取(LLE)或固相萃取(SPE)等技术制备样品对于从血浆、食物和土壤等复杂样品中提取目标分析物至关重要。
12这不仅有助于提高分析的灵敏度,而且还减少了系统的污染(在下一节中讨论)。


LC-MS的常见问题


虽然LC-MS为复杂矩阵的痕量分析提供了一些优势,但必须采取一些预防措施来克服以下问题
挑战在使用这种技术时。13


污染


分析的灵敏度、选择性、重现性和分辨率受到污染物的影响,例如金属离子、邻苯二甲酸盐、聚乙二醇(PEG)、滑脱剂、从各种来源进入系统的水和颗粒,例如:

-试剂和溶剂
-用于制备缓冲液的水
-从玻璃器皿中浸出的化学物质
-微离心管
-进气过滤器
-溶剂线
-仪表部件,如泵密封
-在源和碰撞池中用于溶解洗脱液的气体
-样品本身

污染物可以通过以下方式干扰分析:

-抑制或增强源中分析物的电离
-与分析物形成加合物
-掩盖分析物峰和/或在色谱图中显示为幽灵峰
-使基线产生噪音
-系统和塔身有污垢,需要经常维护和更换部件

减少污染:

-制备流动相时应使用高纯度溶剂、水和试剂。
-必须使用新鲜制备的流动相,以尽量减少微生物污染水流动相和乙腈聚合(ACN)的机会。
-应避免使用肥皂或洗涤剂清洁玻璃器皿,因为它们难以清除,并可能在分析过程中造成干扰。
-必须使用高纯气体(如常用的纯度为> ~ 95%的氮气)。
-氮气发生器必须妥善保养,当压力低于可接受水平时,必须更换气瓶。
-分析物必须从样品基质和色谱参数中提取优化提高分析物峰与干扰峰的分辨能力。


基体效应


在分析生物样品时,其他样品成分可以抑制或增强源中被分析物的电离。为了尽量减少基质的影响,应将感兴趣的分析物与基质分离。因此,样品制备是LC-MS分析的重要前提。虽然这减少了基质效应,但很难从基质中只提取分析物。为了防止干扰化合物的共洗脱色谱参数也可以优化.在无分析物基质中制备标准溶液(基质匹配)也有助于解释基质效应。已知浓度的同位素标记内标,经历类似的电离抑制或增强,被用来补偿基质效应。


结转


由于样品携带,在高浓度样品后的空白注射运行中,分析物峰可能出现。这必须通过使用清洁方案来解决,例如重复空白注射、洗针和柱调节,以确保保持分析的灵敏度。


样品损失


分析物,如蛋白质和DNA,可能由于与实验室消耗品(如微离心机管的内表面)的非特异性结合而丢失。分析物的吸附影响测定的准确性和精密度。分析物损失可以通过使用表面附着力低的容器来减少。另一种方法是添加阻断剂,以尽量减少分析物与容器内表面的相互作用。
14


移动相位缓冲器选择


由于在质谱分析之前必须除去柱洗脱液,因此只能使用挥发性缓冲液,如甲酸铵或乙酸铵,这些缓冲液不会在源中沉淀,可以用于制备流动相。


维护


质谱仪的定期维护必须按照预先确定的时间表进行,以确保仪器的准确性、再现性和无故障运行,并尽量减少计划外停机时间。


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