严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)已经引起了全球COVID-19大流行和有一个毁灭性的影响2019年12月以来人类的生活和生计。然而,全世界科学家和公共卫生机构的令人难以置信的努力导致了紧急使用授权和快速部署的基于抗体的对策,包括治疗性单克隆抗体(mab),恢复期的等离子治疗和信使RNA,灭活和viral-vectored疫苗。基于抗体的应对措施的成功依赖于抗体的中和能力SARS-CoV-2感染通过绑定到SARS-CoV-2峰值(S)糖蛋白,它与通常结合血管紧张素转换酶2 (ACE2)宿主细胞来实现细胞条目。抗体的有效性通常以一个中和试验。然而,这种分析需要SARS-CoV-2隔离和处理在一个生物安全级别3 (BSL-3)实验室遵循BSL-3实践根据美国疾病控制与预防中心生物安全准则。BSL-3实验室是有限的几个机构,限制范围评估的成功基于抗体的对策。一种可行的选择是使用pseudovirus代替SARS-CoV-2中和化验。假病毒可以安全地处理常规BSL-2实验室中广泛使用,在大规模使用,开放治疗发展的机会。
pseudovirus的定义
假病毒合成嵌合体是由代孕病毒核心,来源于父母病毒,和一个信封表面糖蛋白来自一种不同的病毒。1父病毒用于生成pseudovirus通常是一个弹状病毒(如水泡性口炎病毒(VSV))或逆转录病毒(如小鼠白血病病毒(MLV)或1人类免疫缺陷病毒(hiv - 1))1。父病毒基因组复制所需修改删除重要基因,包括本机包膜糖蛋白基因,而不是,一个荧光素酶报告基因编码或插入荧光蛋白。1假病毒因此经历一个完整的复制周期缺陷,只能接受一个感染周期。1
图1: 假病毒表达SARS-CoV-2 S糖蛋白结合ACE2在宿主细胞表面的受体TMPRSS2蛋白酶裂解年代导致构象变化和病毒和宿主细胞膜的融合。融合后,基因组是释放到细胞细胞质基因组编码的记者表示,这是量化的活动的一种乐器。
成功pseudovirus感染宿主细胞,记者荧光素酶或荧光蛋白表达,可量化的活动分别用光度计或荧光计(图1)。自从进入一步感染宿主细胞是由信封表面糖蛋白,当务之急是用于pseudovirus感染的宿主细胞表达适当的受体结合的包膜糖蛋白的兴趣。因此,假是优秀的代理人来研究函数与包膜糖蛋白和病毒进入的过程。病毒包膜糖蛋白,调节进入宿主细胞的一个主要目标的免疫系统产生抗体中和病毒条目(图2)。1,2因此,病毒囊膜糖蛋白疫苗和马伯的兴趣发展的许多病毒大流行和流行潜力(如流感,埃博拉病毒和COVID-19)。
图2:中和试验采用假病毒表达SARS-CoV-2 S糖蛋白。中和抗体针对S糖蛋白防止ACE2的受体结合,因此后续步骤的融合、基因组基因表达释放和记者。
Pseudovirus平台
假的巨大优势在评估疫苗和马伯的功效被用于动物模型和临床试验。几个SARS-CoV-2年代基于VSV的假,MLV和艾滋病全球平台已经开发和正在使用评估的成功基于抗体的对策。
VSV的平台
水疱性口炎病毒制造假的使用平台,最初VSV病毒ΔG-G * pseudovirus必须生产。这是通过使转染两个质粒,一个编码VSV病毒核心基因缺乏本地水疱性口炎病毒糖蛋白和包含报告基因ΔG),另一个编码VSV病毒包膜糖蛋白(G *),成HEK293T细胞的转染。3这导致水疱性口炎病毒的生产ΔG-G *假之前可以用于感染HEK293T细胞转染质粒表达SARS-CoV-2 S糖蛋白。VSV病毒ΔG-G * pseudovirus基因组包含所有复制所需的核心组件和一个报告基因,但缺乏组装所需的包膜糖蛋白和假的萌芽。3质膜上的糖蛋白表达分别飙升从而促进水疱性口炎病毒的组装和萌芽Δg假。水疱性口炎病毒G *的结转ΔG-G * pseudovirus用于感染预防的中和抗体针对G *。VSV病毒Δg假病毒的感染可以直接用于HEK293T细胞表达ACE2受体(HEK293T-ACE2)或维洛细胞允许绑定和条目。水疱性口炎病毒生产时间表Δg pseudovirus 5到6天。3
MLV和艾滋病平台
MLV和HIV平台采用三个质粒转染成HEK293T细胞:
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质粒编码MLV /艾滋病毒核心基因,呕吐和波尔,但缺乏MLV /艾滋病毒包膜糖蛋白env基因
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转移载体质粒编码萤火虫荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,Ψ-RNA包装信号,随着5 ',3 '侧翼长末端重复(LTR)地区
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质粒编码感兴趣的包膜糖蛋白,在这种情况下,SARS-CoV-2年代。
转染两天后,可以收集和纯化pseudovirus感染宿主细胞。一般生产时间表MLV-S / HIV-S pseudovirus是两天。
假的优点和局限性
如下所述,假提供几个优点和一些局限性相比本地病毒列为BSL-3代理。
优势
1。假病毒很容易扩展,比本地病毒基因本身稳定和安全。1,4
2。假病毒允许进入细胞的机制的研究新型病毒和病毒不能在细胞培养中培养。4
3所示。进入宿主细胞过程和目标细胞取向可以量化通过报告基因(图1)。1
4所示。由高致病性病毒进入细胞的研究声波测井的3或4设施(可访问性有限)需要进行访问。作为复制的假病毒有缺陷,他们可以安全地处理常规BSL-2设施。4
5。稳定细胞系表达可以生成或缺乏感兴趣的基因。1
6。病毒载体基因传递和疫苗可以生产。4
7所示。疫苗和治疗性单克隆抗体的疗效可以通过量化评估中和抗体的中和试验(图2)。1
8。病毒进入抑制剂的治疗潜力进行科学研究。1
限制
1。 信封表面糖蛋白密度pseudovirus可能不一定反映原始密度对本机病毒。
2。 尽管一些研究观察pseudovirus和本地的一个重要关系中和病毒,不过一些研究报道缺乏相关性。5
3所示。 假病毒使用HIV生成平台不能用于评估的成功基于抗体的对策在感染艾滋病毒的人抗逆转录病毒疗法(ART)。艺术包括核苷类似物可能会干扰报告基因的逆转录和集成步骤中和试验从而导致假阳性。1因此,一个替代平台基于VSV病毒或MLV必须使用。
在对抗SARS-CoV-2使用假
Neerukondaet al。已经开发出一种简单、高效SARS-CoV-2 pseudovirus系统,是基于一个HIV平台。1尽管几个SARS-CoV-2 pseudovirus平台存在,系统由Neerukonda开发et al。相对达到更高层次的pseudovirus感染在相对较短的时间内,它允许基于抗体的筛查对策在大规模接种疫苗或感染的个体。1pseudovirus感染的目的,他们设计了一个HEK293T细胞稳定表达ACE2的受体和TMPRSS2蛋白酶(HEK293T-ACE2 / TMPRSS2)支持高级水平的pseudovirus感染目前相对于其他细胞类型。1这个试验,发表在PLOSONE,是一个重大的进步,目前受雇于科学家和公共卫生机构在全球范围内的快速筛选和测试基于抗体的应对措施对现有和新兴SARS-CoV-2变体。此外,该系统还可以为研究其他病毒的人类健康的重要性,包括流感,埃博拉病毒和乙肝和丙肝。
引用
1。Neerukonda S.N.;弗格森爵士,r;Herrup r;刘,美国;王、t;武田,k;杨,y;林、T.-L;王,w; Weiss, C.D. Establishment of a well-characterized SARS-CoV-2 lentiviral pseudovirus neutralization assay using 293T cells with stable expression of ACE2 and TMPRSS2.《公共科学图书馆•综合》。2021年,16岁,e0248348。doi:10.1371 / journal.pone.0248348
2。Nath Neerukonda,美国;弗格森爵士,r;Weiss, C.D.中和抗体针对守恒的干地区的流感病毒血凝素。疫苗。2020年,382。doi:10.3390 / vaccines8030382
3所示。Zettl f;迈斯特,T.L.;Vollmer t;费舍尔,b;Steinmann, j .;,杰哈卡胡奇a;p V 'kovski;托德,d;Steinmann大肠; Pfaender, S., et al. Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes.疫苗。2020年,386。doi:10.3390 / vaccines8030386
4所示。小米,J.K.;惠塔克,广义相对论小鼠白血病病毒(MLV)的冠状病毒Spike-pseudotyped粒子生产和感染。生物Protoc。2016年6 e2035, doi:10.21769 / BioProtoc.2035
5。王,p;Nair,硕士;刘,l;Iketani,美国;罗,y;郭,y;王,m;Yu, j .;张,b; Kwong, P.D., et al. Antibody Resistance of SARS-CoV-2 Variants B.1.351 and B.1.1.7.自然。20.
