液体活检成年

工业化

随着液体活检作为实验室开发的测试或批准的诊断方法从研究实验室转移到临床，自动化将是至关重要的。明显的好处是更高的吞吐量、更大的一致性和消除人为错误，所有这些都是工业化实验室诊断的特征。液体活检也是如此，特别是在样本收集和准备步骤。

Biodesix (Boulder, Colorado, USA)最近展示了一种从血浆中提取循环RNA的新方法。为了实现这一目标，Biodesix与Norgen Biotek (Thorold, Ontario, Canada)合作，后者专门从事样本收集和保存。

随着分子检测的发展，自动化对于保持一致性和获得高质量的检测结果将变得越来越重要。Biodesix公司已经找到Norgen公司，在不牺牲性能的情况下实现Biodesix GeneStrat测试平台的自动化。

GeneStrat是一种液体活检类型的基因组分析，指导肺癌患者使用靶向治疗。该测试使用Bio-Rad开发的高灵敏度液滴数字PCR，量化循环肿瘤DNA和RNA的基因突变和变异。治疗医生为他们的肺癌患者订购了GeneStrat测试。该测试提供了EGFR增敏、EGFR耐药、KRAS和BRAF突变以及EML4-ALK、ROS1和RET融合变异的结果。

GeneStrat的具体改进包括自动化商用实验室开发的EML4-ALK mRNA融合变体测试(LDT)， EML4-ALK是一种与肺癌有关的基因。LDT是一种特定的监管名称在体外在一个实验室中开发和使用的诊断方法。该升级使血浆RNA分离和RNA浓缩过程机械化。

开发和运营副总裁Gary Pestano博士说:“我们与Norgen Biotek合作，改进了他们的血浆/血清循环和外泌体RNA纯化试剂盒，以及RNA清理和浓缩微洗脱试剂盒。“这个过程在Hamilton microLAB Nimbus平台上实现了自动化。”

为了展示液体活检的发展，Pestano将GeneStrat描述为一种替代方法，不是传统的活检，而是取代传统的肿瘤组织基因组检测，或者是在肿瘤组织可用之前的一种测试选择。

GeneStrat通常与Biodesix的另一种检测方法veristat®一起使用，veristat®是一种基于血液的蛋白质组学检测，用于EGFR突变检测阴性的非小细胞肺癌患者。Pestano补充说:“这种策略整合了基因组学和蛋白质组学生物标志物，以告知肿瘤突变状态，并测量患者对肿瘤的免疫反应和癌症的侵袭性。”

PCR-proliferation

基因扩增方法，大多数基于pcr，作为NGS的前端或作为许多液体活检的主要吸引力。临床相关的PCR分支的数量正在增长，甚至分支都有分支。

COLD PCR最初是由Dana-Farber癌症研究所开发的自然医学纸2008年，随后获得Transgenomic(美国康涅狄格州纽黑文)的许可。包括Transgenomic在内的几个研究小组随后改进了这种方法。ICE COLD PCR就是其中一种变异，它有好几种变异优势与传统PCR相比，特异性等位基因非特异性，广泛的样本接受性，适用于所有重要的检测平台，灵敏度提高了500倍。

利用这些优势，precpio(美国康涅狄格州纽黑文)于2017年与Transgenomic合并，正在将ICE COLD PCR (ICP)用于液体活检。ICP通过选择性扩增优先富集突变DNA序列，而不是野生型DNA，从而在序列改变检测低至0.1%时，识别与癌症相关的突变的敏感性提高了500倍。该灵敏度水平通常被公认为用于基因检测的液体活检的标准，并可应用于患者治疗反应、疾病进展和复发的监测。

液体活检在患者健康和护理质量方面的重要性，需要研究目前如何利用液体活检和传统活检。

为了提供关于患者状况的信息，外科医生保存了来自实体肿瘤的部分活检组织，用于组织学和基因组检查。他们得到的是特定肿瘤基因足迹的第一天图片。Precipio公司首席执行官Ilan Danieli指出:“随着患者接受治疗，肿瘤会适应，肿瘤的生物学可能会发生变化。”“由于这些变化，治疗可能不再有效。肿瘤停止缩小并开始生长。重新活检几乎从来没有做过，所以没有任何新的遗传信息，从那时起，医生们经常在黑暗中工作。”

在某种程度上，这是由于前基因组时代的遗留心态，当时活检的目的是对肿瘤的起源和阶段进行分类。在许多情况下，除了成本之外，对患者安全的担忧以及让他们接受第二次(或第三次)侵入性和危险的手术是最初的活检仍然是最初遗传信息的唯一来源的主要原因。然而，当临床医生避开周期性的基因组测试时，他们就把基因组分析的全部力量都放在了桌面上。

Danieli解释说:“ICE COLD PCR最重要的价值在于，它消除了通过重复检测来监测患者当前状态的成本障碍。”“你不想知道化疗没有效果，在几个月的治疗后，CT扫描显示肿瘤在生长，而不是缩小，这表明治疗停止了。基于ICE COLD PCR的液体活检可以让你根据需要经常进行检测，以便尽早发现变化。”

据达涅利介绍，ICE COLD检测的成本仅为150美元，而目前提供的竞争性液体活检检测的价格高达数千美元。

验证

循环肿瘤DNA (ctDNA)检测或液体活检的基础科学已经超过了基于这些技术的经过验证的方法的引入。缺乏适当的标准是最严重的挑战。

SeraCare Life Sciences (Milford, Massachusetts, USA)已经组装了一套临床基因组学验证和质量控制工具，最新的是SeraseqTM髓系DNA和髓系RNA融合参考材料。液体活检的开发人员使用这些参考标准来确保下一代测序(NGS)骨髓性癌症检测的敏感性和稳健性。

髓系癌症的分子分析正从传统的单一方法(如FISH和qPCR)转向多种NGS分析。单基因分析针对一个独特的基因序列。由于髓系癌症可能涉及多种突变，单一检测既昂贵又耗时。

髓系突变和髓系融合混合产品涵盖了广泛的突变类型，从临床重要的单核苷酸变体到基因融合。

DNA突变试剂盒由可操作的体细胞突变的纯化DNA混合物和高度特征的健康个体的基因组背景组成。“可操作的”突变是医生寻找的基因组差异，以检测特定的肿瘤类型。该基因组合是典型患者样本中突变型和野生型基因的代表，约95%为野生型，5%为突变型。首席科学官Russell Garlick博士说:“我们生产它们是为了代表基因分型试验可能在患者身上看到的结果。”

而不是特定的DNA突变，RNA试剂盒包含了可操作的RNA融合的混合物。用户将他们用于患者样本的相同方案转换为互补DNA，并通过基因扩增、测序等进行分析。

通过复制RNA和DNA的有意义的遗传变异范围和相关频率，该产品将帮助液体活检和其他产品的开发人员验证他们的分析性能。从某种意义上说，这些试剂盒是典型患者样本的人造制剂，用于用户在液体活检中寻找的遗传变异和融合。它们作为最终用户使用的样品制备、分析和数据系统的标准和独立的验证手段。

该试剂盒通过精心设计的制剂解决了液体活检的标准差距在网上然后对所研究的分析平台进行了精确的合成和配制。工具包也可针对特定目标进行定制。

“假设你想验证一种罕见的FLT3基因ITD的检测方法，这种突变与血液病癌症有关。这种基因在外显子中具有内部串联复制，很难检测到，但我们可以设计所需的变体并将其混合，”Garlick说。“用户将有信心，如果他们能在我们的样本中检测到FLT3 ITD，他们就能在患者中检测到它。”

枯萎收养?

采用液体活检需要时间，因为科学家、医生和报销机构要达到由方法的固有潜力、局限性和成本确定的平衡点。随着仪器和信息学每周都在改进，液体活检仍然面临一个技术障碍，根据SeraCare的Garlick博士的说法，这是生物学上的而不是技术上的。

“液体活检已经非常灵敏和可靠。”突变基因0.5%的检测限可能会进一步下降。“挑战在于肿瘤是否在向血液中释放遗传物质，并达到可检测的程度。特别是微转移性肿瘤是否脱落了足够多的物质来检测?”

根据Garlick的说法，提高灵敏度只是答案的一部分，“这是一把双刃剑”，因为在大约0.1%的频率以下，生物和分析噪声开始主导信号。“随着检测方法的改进，我们会看到假阳性下降，真阳性上升，但不要指望技术性能会有飞跃式的改善。进展将是渐进的。”