支原体污染:减少细胞培养并发症的风险

哺乳动物细胞培养的微生物污染不仅会威胁培养本身的生存能力，还会对过程的完整性和结果数据或产品的有效性提出质疑。细胞培养环境的性质意味着它恰好满足了许多不同微生物的营养和生长需求，这都可能构成潜在的风险。因此，严格的无菌技术必须与一系列旨在帮助预防或快速检测和消除任何污染的措施一起应用。

在许多潜在的污染物中，支原体物种提出了一个特别的挑战。这主要是因为它们极小的体积使得它们既难以从细胞培养环境中排除，又难以检测到。了解所涉及的风险有助于指导缓解策略，其中包括严格的无菌、试剂的密集过滤和定期使用最有效的检测方法。

支原体的问题

支原体是已知的最小的自由生物。长期以来，它们一直被认为是哺乳动物细胞培养的常见污染物，在当今的实验室和生物制药生产设施中仍然是一个重大挑战。2015年，一项旨在从多个实验室获得无偏倚评估的研究对NCBI序列阅读档案中884个系列的9395个啮齿动物和灵长类动物样本的序列数据进行了分析，结果显示11%的样本被支原体污染。¹

支原体与其他细菌的区别在于其极小的物理尺寸(0.15 - 0.3 μ m)，小的基因组(580 - 2,200 kb)和缺乏细胞壁。它们的大小和多形性的结合使这些生物能够通过标准的0.2微米灭菌级过滤器。由于它们可以达到高浓度而不会产生明显的浑浊，所以在造成损害之前，污染的影响通常是肉眼看不到的。没有细胞壁意味着它们对常用的细胞培养抗生素不敏感，因此很难根除。更复杂的是，有效的抗生素可能对细胞培养本身有毒。

支原体污染可以有几种不同的来源。实验室人员被认为是细胞培养中超过一半的支原体感染的重要来源，这些支原体感染通常来自人类口咽道中发现的生物体。²动物源性细胞培养添加剂，尤其是植物源性材料，都能引起其他类型的支原体。现有的受污染细胞系和设备也构成严重威胁。



支原体污染可能在细胞培养中持续多年而未被发现。^3.虽然它并不总是导致细胞死亡，但它可以改变宿主细胞的行为。这可能导致细胞代谢和形态的改变，染色体损伤和畸变，以及细胞凋亡的增加趋势。在悬浮培养中，细胞增殖率可能降低，饱和密度和凝集降低。

因此，不可能信任污染培养的实验数据，使得重新工作成为绝对的要求。一旦实验室确认有支原体污染，还需要对所有实验室用具、设备和表面进行深度消毒。通常情况下，大量可能因接触而受到污染的材料必须丢弃。因此，支原体污染细胞培养对实验室和生产设施有巨大的财务和生产力影响。

预防策略

管理支原体污染的风险依赖于维持最高水平的无菌技术和良好的卫生习惯。还建议采取以下一项或多项措施:将所有细胞培养材料过滤至0.1 μ m以下，而不是更传统的0.2 μ m，这会遗漏支原体;只购买0.1 μ m预过滤材料;使用支原体检测技术进行定期检测，以便在污染发生时及早采取行动。

历史上，细胞培养基和组分的过滤一直使用孔径为0.2微米的过滤器进行，但现在已经转向0.1微米。这些严格规范背后的一个关键驱动因素是越来越多地转向植物性细胞培养材料，实际上，植物性细胞培养材料比从牛血清蛋白(BSA)等中提取的材料更容易受到支原体污染。⁴图1显示了一个典型的真空过滤装置，其现代化的设计确保了高过滤效率、快速流速和高通量，这对于维持细胞培养实验室的生产力至关重要，同时在降低污染风险方面发挥了关键作用。

图1:适用于孔径为0.1 μ m的细胞培养材料的典型过滤装置。资料来源:赛默飞世尔科学公司。

今天，越来越多的培养基和细胞培养组件作为预过滤产品提供。在购买这些材料时，确保所有材料都被过滤到0.1微米是很重要的。这类产品可以卖出高价，这并不出人意料。那些使用不太常见的细胞培养基、定制培养基或含有额外成分的培养基的设施不能总是获得预过滤的产品，因此必须进行现场过滤。许多人选择多种方法的组合。

定期检查的重要性

采取预防措施避免支原体污染提供了管理细胞培养的最佳实践，定期检测这些措施的有效性是至关重要的。唯一可靠的检测支原体污染的方法是直接检测细胞培养。

所有测试本质上都是反应性的;一旦发现支原体污染，培养就已经被破坏，任何结果都必须丢弃。这一问题因使用传统的支原体微生物检测的挑战而加剧。这是一个漫长的过程，结果可能需要28天。然而，最新的快速方法支持更快地确认污染，因此研究人员可以立即丢弃一批细胞培养，采取必要的补救消毒步骤，然后重新开始。

这种损害限制意味着以后需要重复的工作更少。基于pcr的DNA检测现在是一种公认的检测细胞培养支原体的方法，并在短短几个小时内提供全面的结果。图2显示了整个细胞培养过程中的典型采样点。这种早期检测不仅可以最大限度地减少所需的返工，而且还可以迅速采取行动，防止支原体扩散到下游设备、工艺和介质中。

图2:支原体采样点。快速pcr检测支原体感染可以在整个细胞培养生产过程中进行，从接种到收获。资料来源:赛默飞世尔科学公司。

总之

支原体污染是哺乳动物细胞培养中的一个潜在问题。降低风险需要采用严格的无菌操作，并通过应用严格的介质过滤标准和常规使用基于pcr的快速检测来支持。

毫无疑问，预防胜于补救。更有效地过滤介质和成分至膜孔径为0.1 μ m正在成为常态，避免了与使用标准0.2 μ m灭菌级过滤器相关的问题，后者无法阻止支原体的通过。高过滤速率和高通量过滤系统使实验室更容易实施预防策略。

与此同时，预过滤材料的商业可用性也在不断增长。这些经过验证和认证的材料无需进一步过滤。但对许多人来说，预过滤的细胞培养基可能不是一种选择。例如，定制介质和特殊材料仍然需要现场过滤，或满足当地规范。

最后，支原体快速检测的出现和接受意味着实验室可以很容易地对细胞培养进行定期检测，并几乎立即知道是否存在污染问题。然后，他们可以迅速采取行动，清除受影响的培养物，防止进一步传播。快速检测——特别是与传统的28天得出标准微生物检测结果相比——最大限度地减少了工作损失和重新工作的需要。

引用:

1. Olarerin-George AO, Hogenesch JB。通过NCBI的RNA-seq档案调查，评估细胞培养中支原体污染的流行程度。核酸测定．2015年,43(5):2535 - 2542。doi:10.1093 / nar / gkv136
2. 李志强，李志强。支原体污染在细胞培养中的预防和检测。细胞J．2021; 13(4): 203 - 212。PMCID:PMC3584481
3. 杨晓明，杨晓明，杨晓明。用聚合酶链式反应检测支原体污染。在:克里i(编)癌细胞培养．分子生物学方法(方法和协议)。2011.胡玛纳出版社。doi:10.1007 / 978 - 1 - 61779 - 080 - 5 - _8
4. 王志强，王志强。支原体污染的再发:预防策略。国际生物过程。https://bioprocessintl.com/downstream-processing/filtration/the-reoccurrence-of-mycoplasma-contamination-prevention-strategies-184084/．2009年2月1日出版。2021年11月17日访问