克服Western Blot重复性问题:产生更准确可靠数据的技巧

western blotting的目标是可靠地检测和量化蛋白质表达水平。如果执行得好，它们可以是准确的和具有成本效益的。

但是，根据Bio-Rad对北美科学家的一项调查，近一半的科学家报告说，他们的western blot至少有四分之一的时间失败。此外，测量变异的10人中有7人报告他们的结果不可重复(%CV > 10%)。这些结果表明，大多数科学家发现精确量化他们的western blots并生成可靠的数据具有挑战性。

这篇文章概述了关键的工作流程步骤，以帮助研究人员更好地进行western blots。通过在这些步骤(样品制备、凝胶电泳、凝胶转移、蛋白质检测和图像分析)中执行最佳实践，研究人员可以期望获得良好的western blot数据。

步骤一:在样品制备过程中优化裂解是至关重要的

在样品制备过程中，科学家应该比较裂解方法(用于打开细胞的方法)，并优化裂解缓冲液，以最大限度地提高目标蛋白的溶解度和回收率。此外，需要尽量减少污染和蛋白质降解。

清洁的工具和ph值中性的水可以减少污染，而冷的材料可以减缓蛋白质的降解。这意味着使用冰冷的缓冲液并立即处理组织，或者快速冷冻并在-80°C保存组织。¹

科学家可以通过考虑蛋白质的细胞位置来优化它们的裂解缓冲液。¹例如，RIPA裂解缓冲液是提取核蛋白的首选。如果目标蛋白产量低，科学家应该考虑对低丰度蛋白质进行分馏富集。¹

存在广泛的细胞破坏方法。基于洗涤剂或基于酶的方法是温和的，适合从细胞中提取蛋白质。通常需要更严厉的方法，如超声或压法来破坏组织。如果使用更严厉的方法，应避免起泡，因为它会降低蛋白质产量。¹

裂解可以释放影响蛋白质稳定性的蛋白酶。加入蛋白酶抑制剂的混合物以防止蛋白质降解。为获得最佳效果，裂解缓冲液配方应根据目标蛋白的要求进行调整。例如，为了保存sumo化，最好加入异肽酶抑制剂蛋白，而对于泛素化，则应在裂解缓冲液中加入乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)和碘乙酰胺(IAA)或n -乙基马来酰亚胺(NEM)。¹

第二步:用正确的材料进行凝胶电泳

电泳根据大小分离细胞提取物中所含的蛋白质。为了实现最佳分离，科学家们应该考虑凝胶类型、凝胶和运行缓冲液的化学性质，以及样品中蛋白质的总量。

凝胶类型是根据目标蛋白的分子大小来选择的。²具有较高百分比聚丙烯酰胺(10%或以上)的凝胶具有较小的孔隙，可以分离小蛋白质(<15 kDa)。分子量较高的蛋白质应该通过含有较低聚丙烯酰胺百分比的凝胶。梯度凝胶(其中聚丙烯酰胺百分比从上到下增加)可以分离具有广泛分子大小的蛋白质。

许多类型的缓冲液用于凝胶电泳。例如，Tris-acetate凝胶和XT或基于tricine的缓冲液为大蛋白(>250 kDa)、肽测序或质谱应用提供了最佳的分离。Tris- hcl凝胶与Tris/甘氨酸/十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液价格便宜，易于内部制备。如果需要较长的保质期，TGX凝胶的保质期为一年。^3.

为了避免凝胶负载不足或过载，并确保下游步骤的准确量化，科学家应该在加载凝胶之前测量样品中的总蛋白质。商用试剂盒可用于测量样品中的总蛋白质浓度。为了比较蛋白质水平的差异，最好的做法是在检测的线性范围内加载样品。⁴为此，进行稀释系列测试，以确定在凝胶上提供线性比例蛋白质信号的样品加载量的范围。

第三步:转移取决于吸墨膜和转移方法

在这一步中，蛋白质通过电泳从凝胶转移到膜上。有两个重要方面:选择吸膜类型和转移方法。

聚偏二氟乙烯(PVDF)或硝化纤维膜用于western blotting。PVDF膜具有较高的剥离和再探测机械强度，可以转移疏水或膜蛋白，与含有sds的缓冲液配合良好，但需要预先浸泡在甲醇中。硝化纤维膜具有优良的信噪比，不需要甲醇预处理。然而，它们很脆，含有sds的缓冲液会抑制蛋白质结合。^3.

有几个传输方法的选项:^3.

• 湿法:最流行的方法，湿法传输在电压、印迹时间、冷却和蛋白质大小方面都很灵活。
  
• 半干式:传输时间为15-60分钟，装配更容易，这种方法因其高吞吐量和需要不连续缓冲系统而被首选。然而，由于缓冲区耗尽，延长传输时间是不可能的。它最适合30-120 kDa大小的蛋白质。
• 快速半干燥:这些系统在短短三分钟内完成各种蛋白质大小的转移。他们通过使用专有的缓冲和材料来实现这一点。⁵

为了得到最好的结果，研究人员应该优化转移方法，尽量减少膜的处理。

第四步:用良好的抗体实践最大化信号

为了western blot的成功，一个好的一抗必须是敏感的(向目标蛋白提供强信号)和具体的(不与其他蛋白质结合)。最好的商业抗体提供各种细胞裂解物的性能数据，并推荐使用浓度，但科学家应该凭经验确定最佳结果的浓度。⁶为了确认一抗是特异性的，科学家必须包括适当的阳性和阴性对照。阳性对照可包括表达靶蛋白的细胞或组织裂解物。二抗(无一抗)样本和已知不表达靶蛋白的细胞或组织裂解液样本可作为阴性对照。

不同的药剂可用于封锁非特定的网站，包括自制配方以及市售制剂。由于每一种抗体-抗原相互作用都是独特的，因此必须注意确保阻断剂是相容的。例如，不应使用脱脂牛奶来检测磷酸蛋白、生物素亲和素/链霉亲和素或碱性磷酸酶。另一个例子，BSA不推荐用于使用BSA偶联肽或磷酸酪氨酸抗体产生的抗体。^3.

为了检测同一印迹上的多个蛋白质，通常的做法是剥离并重新探测或将膜切成单独的条带，以便用不同的抗体进行检测。但使用荧光检测，可以同时对多个目标进行多路复用，并且无需剥离或切割膜，从而节省时间并保存样品。⁷此外，多重检测可以同时检测蛋白质的磷酸化和非磷酸化形式，这在将膜切成条时是不可能的。荧光蛋白印迹法还提供了高达6个数量级的线性检测范围。由聚合物纳米颗粒荧光团组成的新型荧光标签比传统的荧光标记抗体提供更亮的信号，并对化学发光检测提供相当的灵敏度。⁸

步骤五:图像分析和标准化完成Western Blot工作流

在这一步中，测量蛋白质的大小、数量和纯度。

多种软件可用于蛋白质条带的图像采集和定量。在图像分析过程中，首先，科学家在斑点上指定将被量化的区域并减去背景。⁹背景减法主要有两种方法。一般来说，与测量体积箱相比，“通道和带”方法提供了更精细的控制。在背景减法之后，科学家们需要标准化western blot数据，以便在样本中蛋白质表达水平之间进行可靠的比较。

归一化解释了样品制备、凝胶加载和凝胶转移过程中的不一致性，确保检测到的蛋白质水平是实验条件的直接结果。¹⁰传统的家政蛋白(HKP)归一化是一种可靠的方法，如果可以验证HKP不随实验条件而变化，并且它们不用于饱和水平。总蛋白归一化(TPN)是利用整个通道中的蛋白质来归一化表达水平，是一种既简单又快速的新兴技术。¹¹还有一个新的无污渍TPN法这比传统的考马斯蓝染色方法更节省时间，更敏感。¹²

结论

Western blotting通常是一个多天的工作流程，需要做出几个决定并正确地执行几个实验室步骤。为了收集良好的western blot数据，重点应该是优化目标蛋白描述的每个步骤。在此基础上，科学家应该考虑在不牺牲可重复性的情况下简化或自动化工作流程的替代步骤，同时保持整体方法的一致性，以最大限度地减少可变性，增加对结果的信心。

参考文献

1.western blot检测组织裂解物中蛋白质的10个技巧，生物辐射，于2018年10月17日访问

2.为您的应用选择最佳凝胶的提示，Bio-Rad实验室，于2018年10月17日访问

3.最好的做法，最好的西方印迹， biradiations, 2018年10月17日访问

4.Western blot归一化方法， biradiations, 2018年10月24日访问

5.Lin-Moshier Y和Marchant JS。非洲爪蟾卵母细胞的快速免疫印迹法杨振华，杨振华，冷泉港通讯，2013 (3)，doi: 10.1101/pdb.prot072793

6.找到一个好的抗体的基本知识:如何找到一个好的抗体，验证它，并发表有意义的数据， F1000研究，2018年10月17日访问

7.近藤Y, Higa S，岩崎T，松本T，前原K，原田A, Baba Y，藤田M，大川Y。融合图像对western blotting荧光的敏感检测《公共科学图书馆·综合》2018年1月19日;13(1):e0191532。doi: 10.1371 / journal.pone.0191532。

8.荧光蛋白印迹抗体， Bio-Rad实验室，2018年10月17日访问

9.特纳L，哦K。如何和为什么把你的西方印记正常化，生物辐射，，访问2018年10月17日

10.西方印迹的新常态，科188金宝搏备用技网络，2018年10月17日访问

11.ImageLab^TM总蛋白归一化基础教程， Youtube于2018年10月17日访问

12.亚达夫G，哦K。定义定量Western Blot数据的新常态， biradiations, 2018年10月17日访问