表型筛选——科技和技术的进步

表型筛选获得了新的动力与药物发现希望这种方法能提高药物的成功率的批准。¹在本文中,我们看一些最新的筛查工具和他们的应用程序。

表型筛选是什么?

表型筛选本质上允许科学家询问生物学,更好地模仿他们调查的病理学,这基本上意味着使用细胞化验。虽然细胞可能比靶向性提供更多的背景分析,使用纯化蛋白,传统细胞化验使用永生化细胞系生长在人工环境中,这些有一个广泛的限制。²

改变细胞随着时间的推移,文化条件和缺乏相邻细胞或基质的互动都是这些传统的表型分析的局限性。²越来越多的研究人员正在探索工具,如patient-derived细胞或组织、诱导多能干细胞,高分辨率成像和基因编辑技术像CRISPR重新化验,更好地反映错综复杂的人类疾病。²

例如,牛津大学的目标发现研究所首席研究员丹尼尔it带来的高通量筛选设施与牛津不同团体合作,英国和国际开发更多的预测分析来提高目标识别。“我们使用范围广泛的研究科学家在许多生物领域和疾病病理——世界各自领域的专家,”it说。“所以,如果我们想在一个特定的病理生理过程是非常重要的,例如,在伤口愈合治疗性血管生成,我们非常将开发一个屏幕识别调节器,促进组织修复治疗的目标。”

所示与Ayman禅宗的博士最近的研究团队开发了一种高含量成像屏幕使用内皮管形成分析,缩小到384孔板格式。筛选与一个带注释的1280生物活性小分子的化学库确定了类维生素a受体激动剂,Tazarotene,增强在体外血管再生和伤口愈合在活的有机体内。这个含量高屏幕识别已经fda批准的小分子可能会利用在再生医学。³

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表型筛查工具

it团队的主要重点是使用锅遗传工具(RNAi历史,但是现在CRISPR),和小的化合物的主要目标。这是一个重要的区别,因为如果发生表型改变,这使他们能够非常快速地识别目标。“每天在《科学》杂志上,有一个权衡。这里的权衡是可以说有三或四千蛋白质曾经麻醉或探测目标他们适度具体来说,“it说。“这意味着你才真正触及或询问整个基因组的五分之一使用小的化合物。或者,我们可以用CRISPR和RNAi锅基因组工具为了更好地识别目标,治疗很重要,然而本质上消除目标蛋白质,这是一个比一个经典药物不同的机制。在这两种情况下,使用专业的科学家们已经把他们的生命奉献给一个特定的病理或理解特定的细胞通路是关键。”

it目前正在与最近的诺贝尔奖获得者彼得·拉特克利夫合作,与爱丁堡大学和麻省理工学院的科学家们在胶质母细胞瘤模型缺氧。“缺氧问题,一些保护细胞免受放疗治疗恶性胶质瘤。我们的目标是使用彼得的专业知识来帮助我们建立了一个分析,模拟真实的肿瘤组织缺氧。如果我们可以确定小化合物改变缺氧条件下我们可以做神经胶质瘤细胞更容易放疗或temozolomide或其他治疗的组合。”

实验室的主要读出含量高成像,使用荧光显微镜可以把成千上万的图片。该方法利用不同的标签和利用软件自动图像分析。图像分析是由生物学家然后应用在整个屏幕。“这是吞吐量低于plate-based读出,但你会得到更多的信息的图像,It说。”越来越多的高含量成像正向使用AI和深度学习在你想画出更多的信息比主要表型,你看。”

CRISPR筛查的进化

在癌症研究协会在伦敦,史蒂夫·佩蒂特博士致力于开发使用CRISPR探针药物的敏感性和耐药性。他说现在有其他新兴应用的CRISPR用于屏幕。“很明显,CRISPR真的改变功能筛查。在CRISPR出现之前,我们有RNA干扰(siRNA或shRNA屏幕),尽管人们知道有脱靶效应等问题,经常在不可预知的方式影响其他基因,他们开发了算法考虑了和技术工作很好,至少在某些情况下。但是现在CRISPR已经出现,它的易用性和缺乏这些缺点导致了更广泛的采用屏幕。”

实际上,使用CRISPR-Cas9诱变最近的一项研究表明,蛋白质的目标许多抗癌药物目前在临床肿瘤生长发展是不必要的,尽管先前的研究反面证据使用RNAi和小分子抑制剂。⁴此外,药物的功效测试时影响CRISPR用于基因敲除其假定目标,这表明许多人通过脱靶效应诱发其抗癌的活性。

CRISPR的另一个好处是,它非常灵活,佩蒂特说。这意味着您可以扩大细胞系模型的范围,例如,你可以屏幕。“RNAi的关键原因是如此受欢迎的技术,现在CRISPR,基本上是可以摧毁一个基因合成只是一小段RNA,”他解释说。“CRISPR指南很容易合成,你可以在一个非常高吞吐量设置,你可以设计定制库摧毁每一个基因在基因组或一组特定的基因。只要你能得到CRISPR机械进你的细胞,它的工作原理非常可靠。”

经典CRISPR (CRISPR-Cas9)系统由一个叫做Cas9核酸酶,可以用短节目RNA(20核苷酸)。RNA将直接核酸酶在一定网站相匹配的基因组和基因组核酸酶会裂开。双链断裂的修复结果在小插入和删除,导致基因敲除。但现在更多的新兴技术的发展应用。

“我认为这是可能的与CRISPR很有创意,这不是RNAi,佩蒂特说。“RNAi你可以只关闭基因,但由于CRISPR——以及使随机突变基因敲除基因——你也可以精确编辑如果您提供一个模板地区突变。这可以被纳入目标站点CRISPR所以你可以介绍你感兴趣的特定突变。”

这样的一个例子是问题乳腺癌易感基因1突变:重要的是要能够功能分类这些突变是否良性或致病。最近的一项研究使用CRISPR测试所有可能的单核苷酸变异的96.5% (SNVs)外显子编码功能的关键领域乳腺癌易感基因1,发现超过400非功能性错义SNVs,以及大约300 SNVs破坏表达式。这些知识将立即援助临床的解释乳腺癌易感基因1基因检测的结果。⁵在另一项研究中,⁶佩蒂特和他的同事使用全基因组CRISPR-Cas9诱变屏幕识别PARP引起的变异形式在体外和在活的有机体内PARP抑制剂的阻力,发现这些突变也容忍与致病性细胞乳腺癌易感基因1突变导致不同的配置文件对化疗药物的敏感性与其他类型的PARP抑制剂阻力。

“你不能屏幕使用RNAi的详细级别,你设计定制CRISPR目标不同地区的相同的基因,你可以找出哪些领域的蛋白质是重要的对你感兴趣的表型,“佩蒂特说。

还有其他的演进CRISPR现在正在开发的屏幕。“例如,如果你变异Cas9的核酸酶活动,它仍然保留其定位到目标站点的能力,所以你可以融合Cas9转录激活物或阻遏蛋白,和屏幕与CRISPR转录镇压,以及淘汰赛屏幕,“佩蒂特说。”也有一系列的CRISPR工具被开发,将编辑基地造成错义突变而不是插入或删除,或引起的DNA甲基化,或将荧光蛋白可以想象细胞的DNA序列在哪里。这是一个衡量如何灵活的和有用的CRISPR RNAi相比。”

所以CRISPR将表型筛选的一种技术,每个人都转向在未来?“我坚信没有技术回答每一个问题,“it说。“CRISPR是惊人的,这是作为治疗或生物是科幻小说里的东西。但作为目标识别的一个工具,它有一个重要的警告。CRISPR淘汰赛到底意味着,它消除了潜在的蛋白质,否则混合。这是非常不同的从一个小化合物抑制蛋白质还能形成一个复杂的,或者是不积极的。这是完美的例子,一位才华横溢的技术变革,但它不是完美的。没有技术是完美的。”

引用

1。郑W,索恩N和McKew JC。表型屏幕作为药物发现的新方法。药物。今天2013;18:1067 - 1073。

2。Horvath) P, Aulner N, Bickle M,et al。筛选出相关疾病的细胞模型。Nat牧师药物。2016年11月,15 (11):751 - 769。doi: 10.1038 / nrd.2016.175。Epub 2016年9月12日。

3所示。霍沃斯•哈吉禅宗,Nawrot哒,,et al。这类维生素a受体激动剂Tazarotene促进血管再生和伤口愈合。摩尔。”2016年10月,24 (10):1745 - 1759。doi: 10.1038 / mt.2016.153。

4所示。林et al。非标靶中毒是一种常见的癌症药物的作用机制进行临床试验。科学诠释地中海。2019;11:(509)。doi: 10.1126 / scitranslmed.aaw8412

5。芬德利通用,Daza RM,马丁·Bet al。准确的分类与饱和基因组编辑BRCA1变异。大自然。2018年10月;562 (7726):217 - 222。doi: 10.1038 / s41586 - 018 - 0461 - z

6。 佩蒂特是et al。全基因组和高密度CRISPRCas9屏幕识别点突变在PARP1造成PARP抑制剂阻力。Nat Commun。2018年5月10日,9 (1):1849。doi: 10.1038 / s41467 - 018 - 03917 - 2。