实用指导的自信应用差示扫描量热法

在生命科学研究的挑战实现再现性证据确凿的¹,人们普遍认为,在这方面改进是必不可少的持续发展提供更安全的平台。最近的一份报告从一组研究人员在拜耳强调问题的严重性,发现超过75%的公布的数据对潜在药物靶点不能被复制²。可怜的再现性可以归因于几个因素,但改善的一个重要领域是意识的加强,分析技术提供最大的洞察一个关键问题,以及如何最好地应用它们。

在本文中,我们提供实用指导的应用差示扫描量热法(DSC),研究的一个核心技术的稳定性和高阶累积量的蛋白质结构。我们解释DSC是如何工作的,并强调良好的实践,以确保最佳的数据质量。结果数据的解释和价值也进行了讨论。

DSC:基础知识

DSC系统测量样品的摩尔热容的变化,应用热引发的。图1显示了热DSC系统的核心,它包含了细胞和示例解决方案供参考。

图1:核心的DSC热系统的示意图显示了引用和细胞样本。

在分析、能源应用于细胞诱导一个相同,密切监管的温度变化。在蛋白质样本,这加热引发展开,构象变化的过程中,吸收热量,同时改变解决方案的热容(参见图2),展开或变性过程创建一个差距所需能量的保持样品的温度和参考(没有蛋白质)细胞。热力学概要文件创建这一构象变化的测量样品室的多余的能量需求。

图2:DSC数据以热的形式呈现,比热容与温度的一个阴谋,蛋白质展开最初与比热容的上升有关。

蛋白质的主要指标来源于DSC数据:

•热转换中点(熔化过渡中点或熔点)(T_米)。变性蛋白质可逆,T_米温度是本机和变性蛋白质的数量是相等的。一个更高的T_米因此表明更大的蛋白质的稳定性。

•变性焓(ΔH)。焓的变化测量了DSC实验期间的互动与中断相关的能源稳定蛋白质的累积量。因此,DSC数据可以形成一个“指纹”结构构象可比性研究的直接比较,为发展。

其他指标与曲线的形状有关,如T_发病变性的温度开始,评估时也可以证明有用蛋白质的稳定性。这种能力有效地生成多个相关指标的稳定性使得DSC价值从早期筛查、强劲,它可以用来识别潜在的候选人可能目前的发展挑战,通过生产,批次可比性的测试。

优化数据质量

在DSC数据质量方面,有三个主要领域良好的实践能起很大的作用:样品制备;仪器清洗/性能检查;在运行条件的选择。而良好的实践可以通过严格的训练,实现有效的方法开发和熟练操作,功能的最新自动DSC系统可以大大减轻分析的负担,同时提高生产力,如下突出显示。

样品制备

样例透析对缓冲/参考解决方案是一个有价值的预备步骤,确保参考和示例解决方案都是相同的,除了蛋白质的存在。另一种方法是使用期间收集的洗脱缓冲的最后一步蛋白质纯化过程作为参考。这两种技术增强仪器精确检测能力比热容的变化与蛋白质有关,相对于热容小的溶剂,从而最大限度地提高灵敏度。

额外的,样品制备的基本元素是样品脱气,以确保展开在体积恒定的条件下发生,后续数据分析的一个基本假设。

重要的是要确定蛋白质浓度使用一个合适的方法,如紫外可见光谱。摩尔浓度的蛋白质所需的解决方案是完整的数据分析,DSC热谱,浓度也需要确定焓和热容变化与热变性有关。DSC-measured TM可以浓度等参数,因此分析应该执行使用一系列的蛋白质浓度。最后,当DSC用于稳定性检查,应该使用相同的蛋白质浓度为每一个样本。

仪器清洗/性能检查

严格的细胞清洁,使用水和/或洗涤剂、防止交叉污染和是一个先决条件敏感的测量。buffer-buffer扫描是一个简单但非常有效的方法确认没有可衡量的差异在每个单元的输入,系统显示干净,没有污染样本移行,正确操作。性能定期检查与一个已知的标准也是好的做法时保持高度的测量。

在最新的DSC系统,这些重复但测量的关键方面是简化和自动化,这是特别有用,当应用DSC在监管环境。通过提供一致的、可靠的清洗,更新的DSC系统减少buffer-buffer扫描和性能检查,从而最大化吞吐量样本,同时提高数据质量(参见图3)。

图3:增强清洁协议减少基线扫描,提高样品处理量。核糖核酸酶的十六个温谱图所示是生产20小时使用一个自动化的系统,与优秀的再现性。

选择运行条件

运行时DSC实验,扫描速率和温度范围是主要的参数需要仔细考虑。

扫描速率的速率温度是细胞增加,与更高的利率将更快的分析。然而,扫描速度可以影响结果的应用。例如,更高的扫描率一直与扩大在某些蛋白质的热转变峰³。测量在不同的扫描率方法开发,以确定任何影响newly-tested样本是审慎的。

所选温度范围必须足够广泛获取完整的热转变和允许ΔH的准确计算,虽然一个不完整的热可能适合的检测T_米。

再次,现代系统与先进的软件在这一领域提供支持功能,如样本模板的简单设计,存储和识别方法的重复。这些特性减轻DSC的编程实验,有助于消除用户间变化,与自动化性能检查,尤其有助于确保所需的严格监管环境中操作。

最大化信息输出

DSC实验的原始输出数据是一个阴谋的热量输入率作为温度的函数。处理这些数据来生成一个热法和提取感兴趣的指标包括:

•减法的buffer-buffer基线

•创建一个集成的基线

•曲线拟合。

这个数据处理可以艰苦,通常涉及多个数据文件和人类决策的一个元素,在这种情况下,一致性也可以是一个问题。

DSC的进步软件直接应对这一挑战,加速数据分析通过支持同时处理多个数据集,使其更容易充分利用高灵敏度的信息价值DSC测量。例如,最新的智能软件,用户可以同时使用相同的拟合方法和集成多个温谱图基线,以减少主观性和删除不一致的数据分析过程。此外,建立了拟合方法可以保存在应用程序中的其他热分析图研究中,对所有样品保证一致的拟合方法,由所有用户。这提高了T的可靠性_米和ΔH计算。

其他地区的数据分析,人类的主体性是有效地消除热法比较。利用DSC与其他化验确认生产蛋白是高度相似的蛋白质的引用,来评估生产过程的变化的影响,例如,或发展的推出,是至关重要的,以发现任何温谱图之间的区别。创新的软件工具能够执行数据分析和评价在多个DSC热分析图提供客观、定量相似度比较参考。这些工具,结合典型的测量实践和数据处理,提高DSC的可比性研究和生物仿制价值发展。

总之

分析技术的优化应用程序依赖于理解如何开发一个健壮的方法来优化原始数据的质量,以及如何利用过程数据信息价值。DSC是一个强大的、具有成本效益的技术研究蛋白质的构象稳定性,适合许多不同的蛋白质和在宽温度范围内适用。这里提供的指导总结了某些可以采取措施提高其应用,并强调了现代自动化系统的价值与功能,提高灵敏度,生产力和再现性。这样的系统提高了DSC的可靠的区分能力本质上最稳定的候选药物,和最稳定的配方和/或生产批次,把整个生物制药开发周期值。

引用:

¹http://www.materials-talks.com/blog/2017/05/23/the-challenges-of-reproducibility-in-life-science-research/

²http://www.nature.com/nrd/journal/v10/n9/full/nrd3439-c1.html?foxtrotcallback=true

³Duruwoju K.M. et al的差示扫描量热法——一个方法来评估热稳定性和构象的蛋白质抗原的可视化实验(木星),杂志发行121,e55262, doi: 10.3791/55262 (2017)