我们已经更新我们的隐私政策使它更加清晰我们如何使用您的个人资料。

我们使用cookie来提供更好的体验。你可以阅读我们的饼干的政策在这里。

广告

质量控制在汽车使用ddPCR t细胞制造


希望这篇文章的一个免费的PDF版本吗?

完成下面的表格,我们将电子邮件您的PDF版本“在汽车使用ddPCR t细胞制造质量控制”

听与
喋喋不休地说
0:00
注册免费听这篇文章
谢谢你!听这篇文章使用上面的球员。
阅读时间:

嵌合抗原受体(汽车)T细胞高潮来自多个重大科学的进步,从肿瘤测序基因工程和免疫疗法。意料之中的是,汽车t细胞疗法是最值得期待的肿瘤免疫疗法以来方法首先进入诊所。方法利用T细胞的自然能力寻找外国侵略者在体内并摧毁他们,通过有针对性的与选择性的添加促进基因工程。FDA已经批准了三车T疗法已经有它的关注更多,超过650汽车T细胞试验是目前活跃或招聘,根据ClinicalTrials.gov。1一个预测预测,全球汽车t细胞疗法市场到2028年将达到80亿美元。2

只有几年的商业销售在他们的腰带,汽车制造商仍在消除缺陷的t细胞疗法。汽车T细胞不典型的药物和生产提出了独特的挑战。他们是活细胞,这意味着制造商,在某种程度上,取决于细胞的生理运作整合和表达基因在适当的数量。因为这个过程并不完全在制造商的控制下,产生的过程安全有效的汽车T细胞需要细致的质量控制。

减少伤害的风险的病人

汽车的T细胞制造过程始于从病人的血液中提取的T细胞。科学家然后使用病毒载体、转座子系统,或直接插入mRNA转导基因进入细胞的DNA。这允许他们表达汽车蛋白质表面。最后,科学家在生物反应器放大了基因工程细胞,和医生给病人注入自己的修改后的T细胞。制造商需要监控这个过程,以确保适当的细胞功能,不会对患者造成伤害

一个挑战出现在转染或转导步骤:一旦基因传递到细胞,制造商无法控制,它将整合到细胞的基因组。它可以嵌入在一个DNA拉伸调节癌基因表达,从而促进肿瘤的生长。或者,它可以集成到一个沉默区域的基因组,不会表达

除了控制集成的网站,它可以控制多少个副本的挑战基因整合到T细胞的基因组。这影响的安全性和功能细胞。如果基因不整合,细胞不会实现它的目的。相反,如果太多的整合基因的两个副本,细胞会变得有毒。蛋白质产生可能引起全身性炎症反应,称为细胞因子释放综合征或“细胞因子风暴”,会损害器官,导致死亡。调节这一目标,美国食品和药物管理局(FDA)建议制造商使用逆转录病毒/慢病毒载体时,每个细胞的基因拷贝数不超过4个。3因此,制造商必须监控基因拷贝数。

使用ddPCR汽车t细胞质量控制

今天,科学家主要依靠定量聚合酶链反应(qPCR)来量化基因拷贝数,但这种方法只能提供相对的结果。qPCR不能直接量化基因副本;相反,科学家需要比较他们的结果标准曲线。反过来,这需要使用串行稀释生成,这是一个耗时和不可靠的过程。固有的可变性qPCR使得它几乎不可能检测基因存在于每个细胞只有一个副本

相比之下,液滴数字PCR (ddPCR)可以检测基因复制到每一个细胞。虽然ddPCR和qPCR都采用相同的化学,ddPCR直接量化基因序列,提供了更大的敏感性。在实践中,ddPCR将样本划分为成千上万的nanoliter-sized液滴并执行独立的PCR反应的核酸链包含在每一个。的基因将放大和发出的荧光信号,照亮了这个滴存在,而其余滴保持黑暗。这为科学家提供了一个二进制的结果为每个液滴精确量化这些包含目标序列。从那里,你可以计算基因样本的浓度和推导出平均T细胞中基因拷贝数批

直接通过量化核酸序列,ddPCR删除标准曲线的必要性。同时,因为它足够敏感检测每细胞基因复制,制造商可以肯定的告诉,是否他们转染或转导方法是成功的

使用ddPCR和流式细胞术研究转导

在美国国立卫生研究院(NIH)临床中心,萍,博士,证明ddPCR确实能够量化基因序列在T细胞转导使用慢病毒或逆转录病毒载体。金和她的团队T细胞的转导一批基因,然后分离和纯化几车T细胞的基因组和评估转导协议的成功4他们测量了转导效率使用流式细胞仪和量化每使用ddPCR基因组基因拷贝数。

在这项研究中,ddPCR量化是一致的拷贝数。他们发现同样的结果立即样品是否测试或三或六周后的冻结。结果是一致的在三个不同的技术人员,展示技术的高可靠性和鲁棒性。

研究人员检测了两个变量的影响,感染复数(T细胞病毒载体的比例)和离心,转导效率和拷贝数。分别使用流式细胞仪和ddPCR分析,他们发现,转导效率和拷贝数增加感染复数(MOI)——病毒:细胞比例增加,转导效率和拷贝数是直接相关的。最后,他们发现使用ddPCR低拷贝数在较低的范围内通过合理增加的高速离心。

最后,他们绘制的位置使用下一代转基因整合在基因组测序(门店)。在未来,金集团希望利用ddPCR这一步。虽然转染或转导基因随机整合,他们偏爱特定网站的基因组。一旦确定这些网站,金和她的研究小组计划设计专用的PCR探针,使他们能够检测集成在这些网站。总的来说,比上天ddPCR提供了一个较短的周转时间。

综上所述,金的数据显示ddPCR可靠地量化转基因拷贝数在临床T汽车产品和可以补充流式细胞术在支持T汽车制造业的改进协议。当研究人员用流式细胞仪测量莫伊和转导效率之间的关系,ddPCR使他们学习莫伊和拷贝数之间的关系,随后,与拷贝数和转导效率。用一组工具,其中包括ddPCR,汽车制造商t细胞可以更自信的认为他们的产品是安全的,他们将会有效地治疗癌症

金的工作只突出一个地方ddPCR可以帮助汽车t细胞制造,但考虑到其通用性、或许有一天,他帮助这个过程的所有方面,上游和下游。

引用:

1。 搜索:“汽车+ t”:活跃,而不是招聘研究——结果列表。ClinicalTrials.gov。https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=%22car%2Bt%22&Search=Apply&recrs=d&age_v=&gndr=&type=&rslt=。2021年3月19日通过。

2。 的市场洞察力。全球CAR-T细胞疗法市场在2028年价值80亿美元。GlobeNewswire新闻的房间。https://www.globenewswire.com/news - release/2018/05/31/1514897/0/en/global -汽车- t -细胞疗法-市场- - -值得我们- 80亿- 2028 -相干-市场- insights.html。5月31日,2018年出版。2021年3月19日通过。

3所示。 赵Y, Stepto H,施耐德CK。第一次世界卫生组织发展慢病毒载体标准:慢病毒为基础的基因疗法的生产控制和标准化的产品。哼基因的其他方法。2017;28 (4):205 - 214。doi: 10.1089 / hgtb.2017.078

4所示。 刘陆,H, R,等。应用液滴向量拷贝数的数字PCR检测在临床汽车/细胞受体T细胞产品。J Transl地中海。2020;18 (1)。doi: 10.1186 / s12967 - 020 - 02358 - 0


关于作者:

生物制药产品营销主管马克白是Bio-Rad实验室、数字生物学。

广告
Baidu