RT-qPCR-Facts和谬误:采访教授Stephen参赛
从一开始的COVID-19大流行,诊断测试被强调为全球的关键部分包含SARS-CoV-2扩散的措施。在一个新闻发布会上2020年3月16日,博士Tedros Adhanom Ghebreyesus,世卫组织总干事,说测试、隔离和接触者追踪“反应”的骨干,并敦促所有国家“测试、测试、测试”。
RT-qPCR测试,检测SARS-CoV-2遗传物质存在于病人样本,迅速成为主要的方法用于识别受感染的个人。然而,一些索赔和指控PCR一直流传的功能和价值的大流行,导致其使用问题。
为了解决这些误解和沟通技术的真正的优势和局限性,一群PCR专家最近发表评论在国际分子科学杂志》上。188金宝搏备用有幸教授Stephen参赛,盎格鲁Ruskin大学分子医学教授和作者的评论,更多的了解一些事实和错误突出显示。
下面是表达的观点和意见的Stephen参赛,不一定反映官方政策或盎格鲁Ruskin大学的位置。
安娜·麦克唐纳(点):RT-qPCR很快大流行开始时采用的主要方法检测SARS-CoV-2。你能描述的一些关键的技术优势使它一个合适的选择?
Stephen参赛(某人):实际上,前三个PCR测试SARS-CoV-2被设计在一天内的基因组序列已经发表的中国科学家。与任何antigen-based测试这样的闪电般的速度是不可思议的,因此PCR的主要方法。此外,适当的设计、优化和验证RT-qPCR测试是最敏感的,具体、可靠和健壮的方法检测病原体。目前的协议不一样快抗原测试,但他们将在未来(见下文)。
至关重要的是,RT-qPCR测试也容易修改,以适应突变和变异的出现具有非凡的灵活性,一个重要的优势在处理一个RNA病毒,对最初的期望,不断地和迅速变化。一旦特征变异的基因变化被测序,确定要设计测试很简单,最重要的是,立即使用它们。这是与抗原测试,需要新抗体的开发和生产,这一过程需要几个月和非常昂贵。PCR测试可以区分原病毒的变种,即使他们只相差一个核苷酸的变化(例如,变体B.1.1.7 N501Y已内T的核苷酸变化序列编码的蛋白质)。
尽管主流PCR仪器需要30分钟和1.5小时才能完成一个测试,结合快速协议和工具可以减少时间不到15分钟。即便这样也不能充分利用这种技术的潜力,与“极端”PCR显示完成一个测试在不到20秒。我毫不怀疑,在一年或两年的时间这样的工具将商业上可用。此外,将会有便宜的手持式个人特别设备,将快速结果所需的时间和地点。
问:一些声称已经表明pcr测试是不适用的。是什么导致了这些指控,这是错误的信息有什么影响?
某人:这些情绪出现的故意传播虚假信息,加上误导引号和不完整的报告。他们是由人的知识和技术的不了解,但口齿伶俐,依靠公众的无知和缺乏科学的兴趣的细节。媒体也是错误的,因为他们没能区分权威科学的结论基于数据和事实和错误的和不可靠的观点基于谎言和诡辩。
最常见的谎言是PCR的发明者,Kary Mullis声称,不应该用于PCR诊断方法。他做了一个不幸的评论诊断检测的可靠性,但这相关的专门的检测艾滋病毒艾滋病患者,是针对传统凝胶聚合酶链反应,1993年,在实时(qPCR)作为诊断工具。我知道Kary Mullis个人和我确定这是不像我们讨论了他的意见,他很感兴趣,在使用RT-qPCR作为结直肠癌患者预后的工具。
没有辣手摧花,qPCR非常适合诊断检测病原体的至少有三个原因:(1)两个级别的特异性,减少假阳性结果的风险,(2)其敏感性减少假阴性结果的风险和(3)作为一个封闭管过程放大DNA是永远不会释放到环境,尽量减少污染的机会。在某种程度上我们看到相同的不诚实的运动复活造成太多不必要的心痛在1990年代末的MMR疫苗和自闭症。
这些操作是由冷酷的个人和团体的议程,不幸的是不打开任何形式的劝说。PCR测试只是另一个话题,纠结在今天的教义,感情和意见或者,事实上,超过了事实,这一现象已成为熟悉的在政治、教育和健康的环境。虽然很容易想出一个简单的口号,诋毁,减少了一个复杂的问题,一个口头禅,它需要更长的时间去解释那件事充分和敏感。最终有一个讨厌的条纹元素在我们的社会中,听力不感兴趣或学习,遗憾的是,没有疫苗,也没有治愈的愚蠢。这一趋势的一个严重的后果是,公众无法区分真正的奖学金和平衡专家建议从蛇油兜售骗子,骗子。
问:你能解释一下假阳性或假阴性结果的主要原因,如何降低发生的可能性呢?
某人:假阳性结果在一个适当的验证和ce标记PCR测试是由污染引起的或不恰当的解释结果。污染可能会在抽样过程中,提取过程或调剂PCR试剂的测试。这是经常被包括适当的负控制在每一个阶段,即:样品,不包含目标的RNA或DNA。这些控件必须是负的;如果他们和PCR结果是积极的,这意味着,无论目标被放大。这一点尤为重要当很少有目标和分析测试的检测极限附近生成的结果。的分析灵敏度PCR测试指的是最小数量的目标能被探测到的样本,在理论上这是一个分子。它与“分析特异性”,描述的能力测试来检测一个特定的目标,例如,SARS-CoV-2,截然不同,称冠。
然而,不同于“诊断敏感性和特异性”,前者指的是测试的能力来识别个体传染病和后者正确识别那些没有这种疾病的能力。因此真正的PCR阳性很可能没有检测传染性病毒,例如,如果个人无症状已有几个星期下来后一种疾病,而一些病毒颗粒或核酸片段都在场,他们不是临床相关。因此测试的解释错了,不是测试本身。这是一个真正的问题有两个原因:(1)感染剂量的SARS-CoV-2仍然是未知的,(2)qPCR结果输出量化周期(Cq),这并不是一个客观的价值但不同仪器、试剂和操作符。监测参数的组合,包括症状、感染和PCR结果的概率是最好的方法来减少错误的临床阳性。
假阴性,另一方面,可能是由于样本退化处理或存储期间,可与RNA,尤其成问题的抑制剂,可怜的检测方案,没有经验的员工不遵循适当的程序,最不可能,试剂失败。也可能,样本取自一个不包含任何病毒或小,或过度稀释在提取过程中迷路了。这当然是为什么负面测试结果是一个假定的消极和第二个测试一天左右后很可能会导致一个积极的结果,如果个人在感染的早期阶段。
问:在2009年,发表了吗MIQE指南,目的是鼓励更好的实践和更可靠的解释qPCR结果。COVID-19测试开发使用这些指导方针?怎么能准则适用于改善qPCR测试的使用?
某人:MIQE指南旨在研究社区,新测试针对众多的目标正在不断的开发,很难比较结果中生成一个实验室获得的与另一个。此外,他们处理定量测试,从测试SARS-CoV-2有些不同。
然而,指导他们要求透明度对于相关试验设计、测试性能和解释结果的报告。研究人员和公司已经做了英镑的工作在发展中一系列敏感和具体的测试和继续监控新菌株的出现,以确保他们的测试继续产生可靠的结果。应该有更多的开放与共享序列使用的各种测试的细节,但提供的信息通常是声音和信息。
然而,主要的问题已经引起了一些问题是抽样的可靠性测试,运输和提取工作流程,这是远不够理想。有许多不同的试剂和协议,变量技能水平的样品,不同的时间线内运输实践和不一致的存储条件以及不同的RNA提取和浓度过程,结合提高测试结果的可变性,特别是当比较不同考试中心内部或之间的不同的国家。目前迫切需要开发一套明确的指导方针,最优样本集合,应该从唾液SARS-CoV-2以及RNA提取,这将有助于规范,使得整个过程更加可靠。
问:使用qPCR量化病毒载量是特别关注的领域。使用这项技术的主要挑战是什么目的呢?有什么可以采取措施减少模棱两可的结果?
某人:首先重要的是要区分感染剂量和病毒载量。我们仍然不知道怎样SARS-CoV-2感染剂量,即。所需的病毒,使人生病。它易于传播表明它可能很低,但这可能是100年,1000年或10000年病毒粒子。更高的感染剂量可能导致更高的病毒载量,它描述了细胞内的病毒复制量受感染的个人。有证据表明,病毒载量较高导致更严重的症状,可能会导致更糟糕的结果以及导致更多的病毒通过受感染的个人。
标准qPCR测试不能记录准确的病毒复制数据,作为正样本的测试结果只记录一个PCR循环数,例如,25.5。这意味着仪器首次检测到的目标在25.5周期,同时降低Cq值表明,有更多的目标,没有额外的信息告诉多少是不可能的。这需要知识的扩增效率,因为很明显,一个更有效的测试将记录一个较低的Cq早于一个低效率的测试。
量化还需要添加标准,理想情况下认证参考已知拷贝数的RNA,放大在特定PCR循环数。病毒的周期数可以直接相关的标准,给出一个测量量。不幸的是,这种标准仍然不存在。有一个相关的技术,称为数字聚合酶链式反应的技术,这项技术可以提供病毒拷贝数的绝对数量。然而,这项技术并不适合大规模测试,它是昂贵的。最好的解决方案,目前记录测试结果是积极的还是消极的,在个人临床上下文和解读这一结果,如果有疑问,以后重复一天左右。
问:在什么方面你认为流行影响PCR的未来?
某人:无疑将是一个巨大的持续需求,快速测试在医院,照顾家庭,托儿所,机场、邮轮等,最初SARS-CoV-2但一直延伸到其他呼吸道病毒、真菌和细菌病原体。这将推动发展的易于使用的采样,提取和检测设备,可以快速测试多个样本很少或根本没有操作员干预。
同时会有越来越为更多的个人设备的需求,如手持显微射流技术系统,您可以添加少量的唾液、血液、尿液或粪便物质和得到一个快速的测试结果在自己家里的隐私,在医生的手术,甚至在化学家。的速度势PCR及其探测许多目标的能力同时在很大程度上仍是未知的,专注于改善当前协议和引入新仪器和改进试剂只会使PCR比现在更加无处不在。
参考:参赛,穆勒R, G·希普利,诺兰t COVID-19和诊断测试SARS-CoV-2 RT-qPCR-facts和谬误。Int J摩尔Sci。2021;22 (5):2459。doi: 10.3390 / ijms22052459
教授Stephen参赛安娜·麦克唐纳说,科学技术网络作家。188金宝搏备用
