LC-MS对药物代谢物的敏感定量研究

确定药物进入人体后发生的变化是药物开发过程中的一个关键考虑因素。如果不研究它的代谢命运，不了解由此产生的药理反应，就不可能评估药物的疗效和安全性。但是代谢物的检测和定量并不是一个简单的过程，特别是由于生物样品中代谢物的丰度较低，以及所涉及的基质的复杂性。在这方面，液相色谱结合质谱(LC-MS)已成为筛选和鉴定药物代谢产物的最强大的分析工具之一。¹LC-MS领域的进步使科学家能够更密切地分析药物代谢途径和药物-药物相互作用，并改进许多具有挑战性的疾病的治疗策略。

HPLC与LC-MS/MS

马来西亚圣恩大学高级医学和牙科研究所的研究员Mohd Yusmaidie Aziz博士花了数年时间，使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法研究哌喹等抗疟疾药物的代谢物。他解释说，在定量代谢物时，药学科学家通常更喜欢LC-MS/MS，因为它的适用性和敏感性。

Aziz说:“十年前，高效液相色谱法(HPLC)通常用于药物定量。化合物是基于紫外、荧光或电化学检测来识别的。但如今，药学研究人员已经获得了更先进的技术，如灵敏度更高、分辨率更高、动态范围更广的质谱技术。特别是在处理有限的生物样本时，灵敏度是一个重要因素。”

据Aziz说，他使用的LC-MS/MS方法提供了足够高的选择性和灵敏度来分析母体药物及其代谢产物。他说:“在LC-MS/MS操作过程中，化合物将被电离并破碎成化合物的特定产物离子，这被认为是指纹。”“此外，LC-MS/MS在检测微量化合物方面具有非常高的灵敏度。”

这项技术可以在万亿分之一(PPT)的水平上检测分子，为阿齐兹的团队提供了一种测量人类血浆中哌喹及其代谢物浓度的手段，这些代谢物甚至低于母体药物浓度。

抗疟疾药物代谢物的测定

哌喹是一种抗疟疾药物，通常与双氢青蒿素联合使用，因为其生物半衰期长。²哌喹进入体内后，在肠道和肝脏中代谢为半衰期相同或更长的化合物，有时持续3-4周。²

Aziz解释说:“我们对哌喹代谢物量化的兴趣源于这样一个事实，即这些化合物之前都没有在体循环中被检测过。”“确定哌喹在人血浆中的浓度可以帮助我们进一步研究代谢物在体循环中的影响，以及即使在治疗结束后它们与药物相互作用的潜力。”

利用LC-MS/MS, Aziz和他在瑞典哥德堡大学Sahlgrenska学院的合作者开发了一种灵敏的定量测定哌喹及其两种代谢物的方法。该技术涉及将分析物从C18柱上的等离子体样品中分离出来，并在串联质谱仪上进行检测，该串联质谱仪使用ESI源，以正离子模式操作，氘化哌喹作为内标。^3.检测和定量是基于前体产物离子对的质量电荷比(m/z)，这是哌喹及其代谢产物的特异性。

“在运行样本之前，我们确保基于FDA生物分析方法指南阿齐兹说。“在制定方法时，指南中有一些标准需要严格遵守。参数包括精度、精密度、稳定性、回收率和基质效应。”

HIV治疗代谢产物的定量研究

对于由人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)引起的获得性人体缺陷综合征(AIDS)患者，推荐的一线治疗包括两种核苷逆转录酶抑制剂(NRTIs)的联合治疗。⁴从本质上讲，这些分子可以阻止艾滋病毒进入健康的人类细胞时进行自我复制。nrti通过抑制一种被称为逆转录酶的酶来完成这一过程，但首先，分子需要被代谢成活性形式。

“nrti实际上是前药物，”内布拉斯加大学医学中心(UNMC)药学院药学系副教授Yazen Alnouti博士说。“在抑制HIV逆转录酶之前，它们需要细胞内磷酸化为活性三磷酸(TP)核苷酸代谢物。”

由于它们的亲水性、不稳定性以及在血液和组织中的低浓度，很难在细胞内监测这些药理活性代谢物。由于TP代谢物的亲水性使传统的反相色谱分离无效，因此使用替代方法，可分为直接和间接LC-MS方法。⁵直接方法依赖于在非反相液相色谱条件下对核苷酸代谢物的直接定量。另一方面，间接方法包括在反相液相色谱条件下通过代谢物去磷酸化来定量母体核苷。Alnouti的团队研究了直接和间接方法来量化NRTIs拉米夫定(3TC)和阿巴卡韦(ABC)及其代谢物。

Alnouti解释说:“大多数现有的测量外周血单个核细胞(pmcs)中TP代谢物浓度的方法都需要从大量的人类血液(6-18毫升)中提取这些细胞。”“我们希望开发和验证一种敏感的、选择性的LC-MS/MS方法，该方法可用于量化来自小得多的血量(~0.5 ml)的pmcs中的TP代谢物。”

灵敏的LC-MS/MS法测定NRTI代谢物

来自UNMC Alnouti团队的研究人员能够同时测量小鼠血液中两种不同NRTI药物的代谢物。他们还量化了从脾脏、肝脏和淋巴结获得的小鼠免疫细胞中的这些代谢物。该研究的主要作者Nagsen Gautam博士现在是UNMC的助理教授，他澄清说，他们的技术包括使用阴离子交换色谱分离TP代谢物，通过去磷酸化将其转化为母体核苷，并使用敏感的LC-MS/MS方法分析这些母体核苷作为TP代谢物的替代品。⁶他进一步解释说，对于小代谢物分子的靶向定量，大多数在多反应监测模式(MRM)下的三四极杆LC-MS/MS系统将提供高灵敏度和选择性。

他们的结果表明，3TC代谢物的定量下限为10 pg/ml, ABC代谢物的定量下限为4 pg/ml。⁶根据Gautam的说法，这些结果表明，他的团队的方法比之前测量3TC和ABC三磷酸盐代谢物的直接和间接LC-MS/MS方法灵敏12.5到50倍。“除了优化灵敏度，我们还改进了条件，以确保样品采集、制备、LC-MS/MS分析和存储过程中TP样品和标准品的稳定性。这些因素通常是其他方法无法解决的。”确切的条件可以在高塔姆最近发表在《药物和生物医学分析杂志》上的论文中找到。⁶

拥有一种准确的方法来监测有限血液和组织样本中药理活性代谢物的水平，将有助于加快对艾滋病毒/艾滋病患者更有效的抗逆转录病毒疗法的临床前和临床开发。有了优化的LC-MS技术，Alnouti的团队现在专注于追踪体内隐藏的病毒库中的TP代谢物。Alnouti解释说:“由于病毒从隐藏的病毒库(主要是淋巴结)中释放出来，艾滋病毒会在数年后产生耐药性和复发。”“监测这些隐藏库中的活性细胞内tp可以支持优化新疗法，这些新疗法有可能攻击这些秘密点的病毒，并完全根除病毒。”

参考文献

1.肖俊峰;周,b;Ressom, H. W.， LC-MS/ ms代谢组学中的代谢物鉴定和定量。分析化学研究进展，2012,32,1-14。

2.冰斗湖,j .;贝里奎斯特y;天,N.P.;Bergquist, j .;Arvidsson b;抗疟哌喹人类尿代谢物的表征。药物金属底座。生物工程学报，2006,34(12)，2011-2019。

3.阿齐兹，m.y.;霍夫曼、K.-J;人血浆中抗疟疾药物哌喹和代谢物的LC-MS /MS定量。色谱学报，2017，(4):344 - 344。

4.成人和青少年抗逆转录病毒指南小组:在感染hiv -1的成人和青少年中使用抗逆转录病毒药物的指南卫生与公众服务部2009年12月1日;1 - 161。

5.Jansen R.S.;罗辛h;Schellens J.H.;质谱在治疗性细胞内核苷酸类似物定量分析中的应用。质量范围。科学通报，2011,30(2):321-343。

6.Gautam:;林,z;巴努布，m.g.;史密斯，n.a.;Maayah, a;麦克米兰,j .;詹德尔曼，h.e.;Alnouti, Y.， LC-MS /MS同时定量细胞内拉米夫定和阿巴卡韦三磷酸代谢物，药物和生物医学分析杂志2018,153,248 -259。