推动CRISPR革命的进步
基于crispr的基因编辑已经实现在科学界在过去的5年里。尽管与之前的基因编辑方法相比，CRISPR相对简单高效，但研究人员仍在继续改进这项技术。新的进展旨在进行不同类型的基因改变，提高效率，并改善针对不同治疗方法的CRISPR交付。
Inducible Cas9为生成模型提供了更多的选择
CRISPR的一个常见用途是在实验室中生成研究生物过程或疾病的模型系统。在其原始形式中，Cas9在DNA中一个由引导RNA (gRNA)序列决定的位点上产生双链断裂。CRISPR如此受欢迎的一个原因是，针对不同的基因只需要改变gRNA的序列．然而，对于研究人员来说，控制编辑的时间和/或解剖位置通常是有用的，所以诱导模型Cas9仅在外源引入小分子时被激活。
最近，研究人员一直在探索仅在生物体中选定的细胞群中诱导Cas9活性的方法。一个测试方法将miRNA开关与CRISPR-Cas9系统结合起来。这允许在异质种群中特定类型的细胞或特定状态的细胞中诱导Cas9，从而进行基因编辑。在miR-Cas9-ON系统中，Cas9的翻译响应于特定的miRNA而被激活，并且只编辑表达该miRNA的细胞。还有一种miR-Cas9-OFF版本的系统，其中Cas9在缺乏特定miRNA的情况下表达，并且可以与靶向细胞中的荧光报告细胞的gRNA结合，这样只有表达miRNA的细胞才会继续表达荧光标记。
这种方法需要了解感兴趣细胞中的miRNA表达，有时研究人员可能希望基于细胞类型以外的因素来控制时间。斯坦福大学的Michael Lin博士和他的团队试图解决这个问题。“我们认为，对于那些想要敲除或激活特定位置基因的生物学家来说，Cas9是一种更精确的工具，我们会尝试让它受到强有力的光控制。我们已经开发了一种制造单链光开关蛋白的方法，我们认为它可能很好地应用于Cas9的光学控制，”林博士说。为了将Cas9的活性限制在特定的时间或位置，他的团队设计了多种Cas9变体，使其对特定波长的光有反应。这些photoswitchable Cas9品种可以用来同时靶向或激活多个基因，根据所使用的Cas9的特定形式产生不同的扰动。
在没有双链断裂的情况下编辑(epi)基因组
传统的CRISPR-Cas9方法涉及在DNA中进行双链断裂，但这可能会对细胞产生负面影响，并且对于生成所需的编辑并不总是必要的。催化非活性(“死亡”)Cas9 (dCas9)与具有转录调控因子、核苷脱氨酶或表观遗传作者等功能的蛋白质结构域的融合已被用于对基因组或表观基因组进行其他改变，而不会引起DNA中的双链断裂。
通过组蛋白修饰蛋白融合的表观基因组编辑已经使用了几年，但以前缺乏时间控制。实现时序控制可定制的表观基因组编辑系统，研究人员将脱落酸(ABA)系统与dCas9和组蛋白乙酰转移酶结合使用，方法是将dCas9融合到ABA系统的一个组成部分PYL，将组蛋白乙酰转移酶融合到ABA系统的另一个组成部分ABI。然后，他们引入靶向感兴趣区域的gRNAs，引导dCas9到DNA，在外源引入脱落酸的存在下，PYL和ABI结构域结合，允许组蛋白乙酰转移酶乙酰化组蛋白尾部附近。ABA系统的可逆性允许研究这种工程组蛋白乙酰化的稳定性，因为酶不会在目标区域停留很长时间。当脱落酸被清除时，相互作用停止，研究人员不仅可以确定组蛋白乙酰化反应发生了什么，而且还可以确定这种改变及其影响的稳定性。
类似的方法可以用来改变DNA序列。dCas9与核苷脱氨酶的融合被用于一个称为基本编辑，并涉及在不使双链断裂的情况下改变目标区域的核苷酸。这种方法很有希望，但在某些类型的细胞中效率很低。威尔康奈尔医学院的陶氏实验室解决了这个问题优化基编辑器．该论文的共同第一作者、实验室博士后Maria Paz Zafra博士说:“我们从添加核定位信号(NLS)开始，但密码子优化是游戏规则的改变者。这是一个非常简单和基本的想法，但它改变了一切。”这些优化提高了多种细胞类型碱基编辑的效率，据实验室的医学博士/博士生、论文的共同第一作者Emma Schatoff说，“这将使未来的研究方向成为可能，因为它允许我们模拟在患者身上发现的特定癌症突变，并快速轻松地比较同一基因中的不同突变”。
CRISPR疗法的进展
对于一些治疗应用，例如使用嵌合抗原受体修饰的T (CAR - T)细胞，可以从患者体内取出特定的细胞，用CRISPR编辑，然后返回患者体内。在一些组织中，腺相关病毒可用于在体内将CRISPR组件传递到细胞中。然而，这并不适用于所有组织，而且会带来额外的风险。在体内传递CRISPR组件的新方法正在开发中，以推进CRISPR治疗。
其中一种方法是通过核糖核蛋白(RNPs)传递CRISPR组件，北京国家生物科学研究所的陈氏实验室已经应用了这种方法。实验室负责人陈廷博士说:“RNPs相对于病毒传递系统的最大优势是，不会将病毒基因组DNA整合到宿主基因组中。此外，RNPs的半衰期将比病毒表达的基因编辑机器短，因此脱靶效应可能会降低。”她的实验室使用rnp靶向隐性营养不良性大疱性表皮松解症(RDEB)小鼠的皮肤干细胞，显著改善了这些小鼠的皮肤起泡表型。在这项有前途的技术进入临床之前，还有很多工作要做，比如扩大一次可以靶向的区域。陈对这项技术的潜力持乐观态度:“理论上，一旦解决了分娩问题，任何遗传性皮肤病都可以治愈。”
对于像RDEB这样的隐性疾病，通过CRISPR修复任何一个突变的等位基因都可能导致临床改善。对于由显性突变驱动的癌症，需要纠正突变的等位基因，同时保持未突变的等位基因以及附近的野生型细胞不受影响。在某些情况下，例如导致细胞持续增殖的突变KRAS，有自然发生的gRNA靶点只发生在突变的等位基因中，这可能是CRISPR靶向．在另一个案例中，研究人员利用了原间隔相邻基序(PAM)的特异性，这是Cas9切割所必需的。目标序列本身实际上可以容忍gRNA和DNA序列之间的不匹配，这意味着非突变等位基因有被修改的风险。在针对EGFR突变，通常涉及癌症，研究人员写道实验室调查使用了一种gRNA来靶向PAM序列，该序列之所以存在是因为它是由突变产生的，这意味着Cas9只能靶向突变等位基因。在这两种情况下，小鼠模型的疾病负担都减轻了，但并没有消除。无法完全消除疾病可能是由于基因编辑的效率低于100%，或者可能是因为修复突变的KRAS或EGFR不足以消除疾病。许多疗法单独使用是无效的，这种策略与其他疗法联合使用可能更有效。
CRISPR应用于治疗的另一个令人兴奋的可能性是克服异种移植的一些障碍。使用与人体器官大小相似的猪器官进行异种移植目前是不可行的，部分原因是存在猪内源性逆转录病毒(PERV)传播的风险。研究人员eGenesis已经使用CRISPR来克服这个特殊的问题，通过生成PERV-inactivated猪．猪异种移植的其他障碍仍然存在，但这是迈向安全使用猪器官的一步。
基于crispr的技术将继续改进，用于不同的环境，并以创新的方式与其他技术结合，以解决生物医学研究、医学等领域的问题。展望未来，研究人员将不得不努力解决在人类身上使用CRISPR的伦理影响，以及这些新的令人兴奋的CRISPR疗法的成本问题。
