新西方墨点法正常化

免疫印迹应该给你信息真正的实验条件或样本之间的差异。仪器检测蛋白质的研究发现和生物制药。但免疫印迹也可以蒙骗你。矛盾在样品制备,装载或凝胶转移可以倾斜的结果没有规范化。研究人员使用归一化来控制这些实验误差的影响和确保数量的蛋白质印迹反映了生物学。

新的标准化技术比以往任何时候都更容易为研究人员正确的数据在数据点差异。一个知名度较低的技术,称为总蛋白质标准化(TPN),是一种研究人员可以确保他们的数据强劲足以让忠实的比较样本和得出结论。TPN取得了几个关键的进步在称为技术允许研究人员节省时间和提高产量。

在本文中,我们将解释两个主要西方墨点法规范化方法;年长的管家蛋白法和新TPN法。

在过去的30年里,研究人员使用管家蛋白(HKPs)如GAPDH、肌动蛋白和微管蛋白内部加载控制。HKPs可以用来可靠地量化西方的屁股,但只有在某些情况下。

HKPs只工作如果他们表达是恒定的。然而,研究继续显示,HKP表达式可以改变实验条件。^{1 - 4}HKPs的这是一个显著的缺点,研究人员需要花费时间和资源来检查HKP水平范围的实验变量(例如处理类型、组织类型)并确认蛋白质含量保持不变。

HKPs的另一个缺点是,它们经常出现在饱和水平,导致错误的定量。这是因为高溶解产物检测所需的负载通常low-abundance目标蛋白质和HKPs往往表达丰度高。因此,HKP的线性工作范围必须确定。不同数量必须被加载到一个污点来确定样本范围产生一个线性比例HKP的信号。

HKP检测也耗时。除了上述电池的测试,使用HKPs需要剥离的过程探索目标后的膜蛋白,和re-probing HKP-specific抗体。这个过程还引入了变化的结果。

没有污点总蛋白质标准化:HKPs更简单、更可靠的替代品

在过去的十年里,研究人员转向TPN到一个更好的方法来量化蛋白表达。在TPN,免疫印迹分析数据使用一个示例中的总蛋白,因此规范化并不依赖单一HKP。这项技术是更快、更准确、更可靠的比HKP-based正常化。

最好的方法来测量总蛋白在一个污点或凝胶技术是通过没有污点。例如,与朱红色污点,没有污点技术保持其强度随着时间的推移,不牺牲再现性。它也不需要运行样本重复Coomassie蓝色一样。没有污点技术使用专有的凝固态化学,允许可视化在不到五分钟与任何没有污点成像仪启用。没有污点TPN也不需要广泛的优化:不需要调查抗体的污点,在成像之前或染色,使脱色步骤。没有污点的方法不会干扰等下游应用免疫印迹或质谱,所以没有必要重复运行。因此,没有污点优于大多数基于TPN可视化蛋白质的方法,因为它增加了灵敏度和减少现有的工作流程的复杂性,节省研究人员的时间。

没有污点的技术依赖于UV-mediated trihalo化合物之间的反应出现在丙烯酰胺凝胶和色氨酸残基在蛋白质,产生荧光。它使可靠检测任何含有这种物质的蛋白质,这适用于大多数积极研究蛋白质(表1)。⁵蛋白质色氨酸含量较低,只需几秒的曝光时间增加提高了信号。⁶灵敏度也没有污点的技术的一个重要方面,它显示了线性信号的典型示例加载(10至50µg蛋白质)和检测到0.2到5 ng,比Commassie蓝色和与银染色(图1)。⁷

技术进步在药物发现和开发需求的增加吞吐量和处理流程节约资源的利用率和降低成本。没有污点技术快速检查胶和膜的能力意味着科学家可以监视整个西方墨点法工作流关键检查点,包括质量的sds - page分离之前印迹以及传输效率。研究者在药物发现和开发中,没有污点凝胶快速、准确地提供一个可视化确认样品的纯度和产量从净化工作流在30分钟内。⁸

结论

因为再现性的挑战与HKP正常化,TPN最近成为免疫印迹的首选方法标准化等出版物《生物化学》杂志上。没有污点TPN,尤其是出现在大约900个学术论文截止到2017年12月,只有五年以来的介绍。⁹不依赖HKPs免疫印迹量化是传统做法,但没有污点TPN被证明是一个更加可靠和准确的方法。随着越来越多的研究人员采用没有污点TPN,信心在西方的量化能力墨迹会恢复。

肯尼斯写的哦,博士,协作、新技术应用和产品经理在定量蛋白质组Bio-Rad实验室