简化横向流动分析开发中的成分选择

介绍由Klaus Hochleitner博士主办的“简化横向流动分析开发中的组件选择”网络研讨会的要点。，现可供点播在这里．

横向流动分析(LFAs)在速度和易用性方面是无可比拟的，但其开发需要高度知情的决策。从最初的想法和信息收集到设计验证可能需要6-12个月，而监管部门的批准则需要1-2年。尽早并以正确的方式选择关键组件，例如正确类型的硝化纤维(NC)膜，是保持LFA开发在规范和预算范围内的关键。那么，让我们更详细地看看组件选择的一些注意事项。

最基本的


有两种类型的LFA测定。第一个是非竞争性或三明治试验，用于具有两个抗原结合位点的大分子分析物-结合物附着在目标上，彼此不干扰。如果样品中存在目标，则测试线上的信号会增加。一个著名的三明治测试的例子是怀孕测试。

第二种类型被称为a有竞争力的测试它用于没有两个结合位点的小分子分析物。由于不能将多个粘合剂与目标分子结合，因此需要使用包含目标分子的测试线。如果样品中存在目标，则测试线上的信号将会下降。竞争性测试的一个例子是用于测试滥用药物的测试。

反应膜的主要考虑因素

选择正确的膜通常取决于所设计的测试的性质。这是值得测试的许多变种，同时考虑以下:

毛细上升时间

这就是液体(通常是水)在膜表面流过规定距离所需的时间(行业标准是40毫米)。所有供应商都按照规定的毛细管上升时间生产膜。液体通过测试线和控制线的速度决定了测试的灵敏度和特异性。用于水和尿液等含水样品的LFAs通常使用较慢的膜速度(170-185秒)。用更快的膜速度(80-100秒)测试通常用于更膨胀的样品，如唾液和可溶性固体。

所有膜毛细管上升时间规格都有上限和下限。虽然膜的大多数产品将落在范围的中间，但你可能偶尔会得到接近上限和下限的卷轴。这可能会导致问题，例如，对于特别快的膜，由于样品在膜上运行太快，您将倾向于看到假阴性结果，而对于慢的膜，您将得到假阳性信号或膜间隙问题。在极少数情况下，您可能会在规范限制的两端看到问题。在开发过程中，您应该从规格的两个边缘(称为极限样品)测试膜样品。为了做到这一点，您可能必须选择具有不同速度等级的膜(与您感兴趣的毛细血管上升速度重叠)或要求定制的膜具有自己的毛细血管上升时间规范。

膜的支持

在制造硝化纤维膜(NC)时，原料溶解在沸点低于水的有机溶剂中，并倒在固体表面(这可以产生无背膜或有背膜)。无背膜有空气侧和带侧。空气侧结构粗糙且随机，与带侧相比，可增加变异性，降低蛋白质结合能力。带侧结构更密集，更规则，因此具有较高的蛋白质结合能力。与无背膜相比，背膜具有更高的机械强度，但它们只有一个可用的面-空气面。如果您不确定选择什么或对lfa不熟悉，最好选择背膜，因为它易于操作。

膜阻塞

由于其蛋白质结合能力，NC基质是首选，然而，任何不在测试线上的硝化纤维都可能与目标分子结合，严重影响测试灵敏度。为了避免这种情况，可以用两种方法阻塞测试和控制线附近的游离硝化纤维:在制造过程中在膜上涂上阻塞试剂(称为“动态阻塞”)，或者将阻塞试剂集成到样品或偶联释放垫中，以便它们在样品之前沿膜迁移。后者的成本和时间效率更高，但你对你应用到膜上的阻断试剂的数量控制较少。

膜表面活性剂

在NC膜中发现的表面活性剂可以通过使膜更亲水(有助于微调流速)或部分变性(有助于固定抗体)来影响抗体结合。不同的供应商使用不同的表面活性剂，并将其应用于制造过程的不同阶段，因此在使用它们之前，最好的做法是测试这些膜的特定应用。固定化对靶标结合的影响取决于所使用的表位是线性的(它将靶标绑定到单个线性肽链上)还是确认的(它仅在多个肽链接近时才绑定靶标)。即使成功固定，也有可能由于抗体取向而无法获得表位。你应该考虑是否存在阻断结合位点的优先取向，这将影响抗体-抗原相互作用。其次，你应该考虑一旦绑定到目标上，粘合剂彼此之间的距离有多近;如果它们靠得太近，就会造成空间位阻。表位定位通过表面等离子体共振(SPR)可以检查抗体干扰。

护垫呢?

膜两侧的衬垫对性能同样至关重要。例如，在共轭垫的制备过程中发生的错误是最可能导致孔径问题的原因。

横向流动垫	目的	提示
样品垫	在与共轭物混合之前准备样品。	通常包含维持样品关键参数的试剂，但也可以涂有包含阻挡试剂的缓冲液。
血液隔离垫	仅用于血液样本，通过去除红细胞和/或白细胞来减少着色和干扰(例如来自DNA)。
共轭垫	将探测器粒子以一致的体积传送到膜上。	重要的是不要用检测器试剂浸泡衬垫。在干燥共轭垫时，确保它保持稳定和完好无损。
吸收垫(灯芯)	在检测结束时捕获并保留样品。	吸收容量必须大于所应用的样品液体的体积，以避免样品从灯芯回流到膜。

总之，在开发lfa时，有许多重要的方面需要考虑。正确地获取这些参数需要详细了解每种成分、样品和抗体。我们总是建议开发者与制造商密切合作，以避免影响开发过程的常见陷阱。

请教专家
人们无法开发出可行的测试的常见原因是什么?

有很多不同的因素。它可以是任何东西，从检测试剂、衬垫和膜的选择，到衬底卡的选择或设备设置。开发过程中的每一个考虑因素都会影响测试的结果，所以测试所有这些项目是很重要的。

为什么一项测试需要这么长时间才能开发出来，例如COVID-19测试?

LFA通过开发和临床试验进入市场可能需要2-3年的时间。一个好的健壮的测试在研发阶段至少需要一年的时间。尽管在大流行期间，每个人都在尽可能快地工作，但您需要为开发和优化分配足够的时间，以满足测试需求。

你怎么根据表面活性剂来评价一个膜呢?

并不是所有的单克隆抗体(mAbs)在给定表面活性剂的存在下都能很好地工作，2%-3%的单克隆抗体根本不起作用。在早期开发阶段，在各种表面活性剂的存在下进行抗体测试对于优化性能至关重要。不同的表面活性剂会影响测试结果(例如假阳性或不敏感)。

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