188金宝搏备用科技网络探索CRISPR革命:艾米·巴特勒博士访谈
在本周的分期付款188金宝搏备用科技网络探索CRISPR革命，我们专注于CRISPR技术的技术元素。
近年来，CRISPR研究的实验方法发生了怎样的变化?一些研究人员选择使用CRISPR试剂盒进行研究，而另一些研究人员可能决定使用“DIY”方法。每一种的优点和缺点是什么，为什么研究人员会选择采用其中一种而不是另一种?
帮助我们回答这些问题的是艾米·巴特勒博士，哈佛大学生物科学部的主席赛默飞世尔科技公司．
主持人:请您简要介绍一下如何对CRISPR-Cas机制进行基因编辑?为什么研究人员可能会选择利用CRISPR工具进行基因编辑，而不是其他可用的方法?
艾米·巴特勒(AB):在高层次上，基因组编辑是在细胞基因组的特定位点引入特定DNA序列变化的过程。为了实现这一目标，科学家们利用细胞自身的DNA修复过程来实现这些变化。目前所有的原始形式的基因组编辑技术，无论是CRISPR、TALENS还是锌指核酸酶，都是通过在所需编辑的位置或附近的基因组DNA中引入双链断裂(DSB)来启动这一过程。
根据所需要的编辑类型，研究人员依靠细胞使用两大类DNA修复过程中的一种来完成所需的改变。如果研究人员正在创建一个基因的靶向敲除，那么他们将在很大程度上依赖细胞使用一种称为非同源末端连接(NHEJ)的过程来修复DSB。NEHJ容易出错，导致在修复位点插入或删除碱基对。这将导致靶基因的功能性敲除。
第二大类编辑是通常称为敲入编辑的编辑。这些是更优雅的编辑，可以对基因组产生精确的改变，这是我们在考虑基因组编辑技术的前景时所想到的。这可能涉及到单个碱基对的改变，直到外源DNA大片段的插入。在这里，科学家们再次依靠核心核酸酶(CRISPR, TALENS和ZFN’s)在所需编辑的位置引入DSB。对于Knock-in编辑，我们不仅提供基因组编辑核酸酶，还为细胞提供我们称为供体DNA分子的物质，以协助修复。在供体DNA分子中，我们对我们想要引入的DNA序列变化进行编码。当供体可用时，它会驱使细胞使用一种称为同源定向修复(HDR)的修复过程。在HDR过程中，细胞利用供体DNA分子修复DSB，从而在目标位点合并所需的序列变化。
任何靶向核酸酶都可以用于这一过程，但目前市场上采用CRISPR作为基因组编辑核酸酶的首选，因为它是应用最快和最简单的基因组编辑技术。针对基因组的新区域只需要用户创建一个新的引导RNA (gRNA)。然而，赛默飞世尔科技公司和其他公司继续在CRISPR的基础上开发其他技术。我们意识到，尽管CRISPR是一种多功能技术，但它也存在一些可以通过其他技术解决的局限性。TALENS和锌手指)。整个领域的发展正在为一个完整的编辑工具工具箱做出贡献，这将使我们能够探索几乎任何细胞类型的广泛研究问题。
MC:近年来，CRISPR研究的实验方法有什么变化和进步?
阿瑟:这项技术最初是围绕使用DNA质粒来传递核酸酶和grna而开发的。虽然这种方法仍然很受欢迎，但已经有了一个重大转变，即直接将Cas9蛋白和合成grna输送到细胞中。这种方法消除了工具组装和交付到细胞中的多个低效步骤，从而显著提高了编辑效率(通常达到70%或更高)，同时显著减少了脱靶活动。其结果是减少了识别和扩展编辑克隆所需的成本和努力，这些分离的克隆成为更可靠的研究工具。我们为这一领域开发了赛默飞世尔的TrueCut Cas9蛋白和TrueGuide合成gRNA，它们将继续为我们的客户提供优秀的编辑工具。
CRISPR取得重大进展的第二个领域是功能基因组筛选领域。高通量筛选已成为识别参与特定生物过程和疾病的基因的核心方法。传统的方法依赖于RNAi技术，其缺点包括不完全敲除靶基因和相对较高的脱靶活性。然而，与RNAi相比，CRISPR的好处是能够产生完全和永久的靶基因敲除，并减少脱靶效应。反过来，这有可能导致屏幕上出现更高质量的结果，并通过帮助更快、更可靠地识别关键基因目标来加速研究项目。赛默飞世尔开发了LentiArray和LentiPool CRISPR库来支持这种类型的筛查。
MC:现在可用的CRISPR-Cas工具的范围非常多样化。简单地说，每个Cas系统有什么不同?
阿瑟:各种CRISPR-Cas系统已经在数百种细菌中被描述过。其中一些变体，如Cas12/CPF-1和喉炎的症状。葡萄球菌Cas9与Cas9相比具有不同的性质和靶向要求喉炎的症状。化脓性链球菌(考虑WT cas9和大多数实验室使用的主力CRISPR-Cas9系统)。目前，对这些替代核酸酶的要求通常导致基因组内的设计空间更有限，一般来说，它们的编辑效率往往远低于Cas9喉炎的症状。化脓性链球菌．未来几年，这个领域将如何发展将是一件有趣的事情。在CRISPR不断扩大的领域中，真正令人兴奋的是基因的新变种喉炎的症状。化脓性链球菌Cas9能够减少脱靶效应，高保真Cas9变体允许在不对基因组进行永久性编辑的情况下操纵基因表达，CRISPRi和CRISPRa碱基编辑器允许直接改变单个碱基对，而不需要切割和引入供体DNA分子，以及可以改变表观遗传调控的变体。
MC:一些研究人员可能会选择使用CRISPR试剂盒进行实验，而另一些人可能会选择“DIY”方法。它们各自的优点和缺点是什么?为什么研究者会选择其中一种而不是另一种呢?
阿瑟:我们认为基于质粒的方法是“DIY”方法。一般来说，这是许多科学家最先接触到的方法，因为这是文献中首次报道的方法，而且质粒很容易获得。这种方法的问题是，与使用“kitted”Cas9蛋白和合成gRNAs解决方案(如TrueCut Cas9蛋白和TrueGuide合成gRNAs)相比，它往往具有更低的效率和更高的脱靶编辑率。
事实上，使用Cas9蛋白，而不是质粒，可以显著提高编辑效率，以至于研究人员现在经常可以在编辑过的细胞池中进行实验，而无需分离克隆。这为在原代细胞和非分裂细胞中使用该工具提供了一系列可能性。重要的是，使用Cas9蛋白和合成gRNA方法在效率上的飞跃和脱靶效应的减少是使CRISPR在细胞治疗应用中迅速从研究工作台转移到临床的关键进展之一。
MC:我们如何继续开发适用于多种细胞类型的CRISPR工具?
阿瑟:当讨论将应用程序应用到各种各样的单元格时，当前工具的局限性围绕着如何有效地将编辑工具交付到单元格。这就是为什么赛默飞世尔在开发编辑工具本身的同时，也专注于开发交付系统。我们已经证明，将我们的编辑试剂与Neon电穿孔系统相结合，使我们能够将这些工具应用于从主力细胞系到iPSC细胞和原代细胞的各种细胞。在大多数情况下，我们可以找到一种协议来驱动高效编辑，即使是在具有挑战性的细胞中，如人类原代t细胞，我们通常可以驱动90%或更好的编辑效率。
MC:研究人员在CRISPR-Cas实验中仍然面临哪些限制?我们怎样才能克服这些限制呢?
阿瑟:我们正在克服限制，通过对整个流程采取整体方法，使系统更易于使用。我们继续专注于在整个工作流程中开发工具，包括Gibco介质系统、Neon和Lipofectamine CRISPRMAX试剂等交付平台、编辑工具(包括TrueCut Cas9和TrueGuide Synthetic gRNAs)和下游分析工具，以验证所期望的编辑已经实现，并且我们没有引入任何不期望的脱靶编辑。通过采取整体方法，我们已经能够解决不同细胞类型(如iPSC或原代t细胞)的局限性，并推动高水平的编辑效率，这反过来对研究人员快速推进其研究项目的能力产生了重大影响。
赛默飞世尔生物科学部总裁艾米·巴特勒(Amy Butler)接受了科技网络科学作家莫莉·坎贝尔(Molly Campbell)的采访。188金宝搏备用
赶上科技网络探索CRISPR革命的上一期，对Glen Cohenn教授的采访，在这里．
