利用三重检测尺寸排除色谱(SEC-TD)分析蛋白质-蛋白质相互作用

简介

蛋白质形成有序结构复合物的能力是其生物学功能的核心。这些复合物可以是同寡聚物或异寡聚物，可以控制不同的属性，如活性、稳定性和定位。了解这些复合物是如何形成的，以及它们背后的控制机制，是我们了解蛋白质信号通路和它们控制的生理反应的基础。在这一领域特别感兴趣的是致病微生物毒力因子复合物的组装。这些因子由这些微生物分泌，以促进宿主的感染、存活和/或定殖，因此对疾病的发作至关重要。靶向和抑制这些毒性因子的能力可能会导致新一代抗微生物疗法的发展。先决条件是了解导致形成异寡聚物和同寡聚物的机制。为了表征所选微生物毒力因子的蛋白-蛋白相互作用，采用先进的光散射检测器结合液相色谱方法。

材料与方法

材料和蛋白质的制备如所述(见文献1,2,3,4)。

特性粘度和分子质量的测量由SEC- td进行，与尺寸排除色谱(SEC)系统连接到三检测器阵列TDA (Malvern, UK)。TDA包含(i)带有两个光电二极管探测器的静态光散射单元，在7°用于低角度(LALS)，在90°用于直角激光散射(RALS)， (ii)一个差分折射率探测器，(iii)一个光度计，以及(iv)一个微分粘度计。用光度计和折射率检测器测定蛋白质浓度。RALS和LALS数据，结合浓度，提供了分子质量m，使用微分粘度计计算了特性粘度(η)。用OmniSEC软件计算了分子质量和特征粘度。

结果

研究了细菌毒力因子蛋白复合物的构象和形成。使用尺寸排除色谱，结合三检测器阵列，获得了关于这些蛋白质行为的关键信息，如下所述。

均低聚物的形成

均低聚物的形成受多种因素的控制。在这里，研究了钙结合或调节肽的存在的影响。“毒素重复”(RTX)基序存在于病原微生物分泌的许多毒力因子中。钙依赖腺苷酸环化酶毒素来自百日咳博德特拉菌(CyaA)利用RTX重复结构域(RD)引起钙反应。两个RD子域，RC_年代和钢筋混凝土_l(2)对Ca的反应特征^{2 +}绑定(图1)。

图1。钢筋混凝土的水动力特性_年代和钢筋混凝土_l用SEC-TDA分析多肽。钢筋混凝土_年代(A)和RC_l(C)多肽，在不存在(虚线)或存在(实线)5毫米氯化钙₂．这些迹线对应于直角光散射(绿色迹线)、微分折光计(黑色迹线)和微分粘度计(红色迹线)。给出了RC的分子质量(绿线)和特性粘度(红线)_年代(B)及RC_l(D)不含钙(虚线)或存在钙(实线)。

根据直角散射数据(绿色痕迹)和差分折光计(黑色痕迹)，可以推断出RC_l两种Apo (- Ca)分子质量相同^{2 +})和Holo (+ Ca^{2 +})形式(图1)。然而，Apo和Holo形式的保留体积分别为18 mL和22 mL，这表明当与钙结合时，肽具有更小的水动力体积。此外，钙的结合导致特性粘度从13.7下降到3.9 mL.g^－1．与RC相比_l钙与钢筋混凝土的结合_年代保留体积没有变化，但导致分子量从15.1 kDa增加到42 kDa，特性粘度从14.7 mL.g降低到6.4 mL.g^－1．综上所述，这些数据表明，随着钙的结合，RC_l采用较小的，紧密形成的单体构象，而RC_年代形成结构紧密的三聚体，大小与不加钙时观察到的未展开单体相同。

图2。去除一个假定的前肽对ClpP2组装的影响。ClpP2(上图)和ClpP2R13变体(下图)采用尺寸排除层析三重检测进行分析。折射率(黑线)和分子质量(红线)被绘制为洗脱体积的函数。通过静态光散射获得的平均分子量在每个峰的顶部表示。

ClpP2是一种依赖于atp的蛋白水解复合物，被认为有助于的能力结核分枝杆菌在宿主细胞吞噬体中休眠多年。在活的有机体内， ClpP2形成了肽酶活性所需的十四摄像头复合体，尽管这种复合体是如何形成的以及控制机制是什么尚不清楚。一个无序的n端肽序列被提出来发挥调节作用。因此，利用尺寸排除层析三重检测对野生型ClpP2和n端截断型ClpP2R13进行了分析。这些数据如图2所示。ClpP2以单主峰形式洗脱，分子量为140 kDa。这对应于六聚体和七聚体的组合。然而，去除n端前序列后，在482kDa、148 kDa和46 kDa处出现了三个主峰。分子量最大的物种对应于21个聚合物的均低聚物。虽然这比预期的四聚体要大，但这些数据指向ClpP2作为高阶低聚物形成的调节剂的前序。

异质低聚物的形成

许多蛋白质的活性是由不同的调节蛋白(激活剂或抑制剂)的结合所控制的。在此，我们利用SEC-TD研究了细菌毒力因子与特异性调节蛋白的复合物。CyaA是百日咳病原体百日咳博德特氏菌的关键毒力因子。经过Calmodulin (CaM)的结合和激活，CyaA诱导致病cAMP水平的产生。

图3。尺寸排除色谱依次为AC(…)、CaM(——)、AC-CaM复合物(-)三检测器阵列:(a)紫外吸收色谱图，(B)直角光散射色谱图，(C)压差色谱图，(D)分子质量(左y轴，粗线)和特性粘度(右y轴，细线)。

各组分的SEC-TD数据，异质络合物如图3所示。CaM- cyaa催化结构域(AC)配合物的分子量为58.4 kDa，与单体的分子量之和(AC和CaM分别为43.8 kDa和17.2 kDa)大致相等。这些数据有力地表明配合物由CaM和AC以1:1的化学计量组成，这一结论得到了分析超离心(AUC)数据的支持(未显示)。SEC-TD分析的特性粘度数据分别为5.2、4.9和5.0 mL.g^－1分别为AC, CaM和CaM-AC复合物。CaM-AC配合物值较低，说明复合物形成时CaM和AC的压实作用较强。CaM-AC的水动力半径(由AUC确定)始终为3.3 nm，而不是预期的3.7 nm(数据未显示)。综上所述，这些数据指向CaM与CyaA结合的信号通路，形成紧凑的1:1异源二聚体。

最后。催产克雷伯菌(Klebsiella oxytoca, PulD)的膜分泌素是将毒力因子高效分泌到宿主体内所必需的多聚膜复合物的组成部分。为了正确定位到细菌膜上，PulD与伴侣蛋白PulS结合。利用SEC-TD研究了PulS与PulD S畴(Sdom)的相互作用。数据如图4所示。

图4。通过SEC-TD分析了Sdom(左图)和PulS-Sdom配合物(右图)的流体力学性质，包括折射率(实线，左轴)、分子质量(实方，右轴内)和特性粘度(开方，右轴外)。

分子量测定证实了Sdom:PulS 1:1配合物的形成，22.1 kDa。Sdom和Sdom:PulS配合物的特性粘度分别为16.9和5.9 mL.g^－1分别。这些数据，加上特征黏度值为4.4的Sdom和2.5的Sdom:PulS，强烈表明Sdom形成了一个细长的无序结构，而Sdom:PulS络合物形成了一个紧实的有序结构。PulS和Sdom的水动力半径值分别为1.7 nm和2.5 nm，而Sdom:PulS配合物的水动力半径值仅为2.7 nm。

结论

蛋白质信号通路通常是复杂的，涉及许多不同的成分，往往是多蛋白信号复合物。理解异低聚物和同低聚物形成背后的机制对于理解这种复合物的调控和活性至关重要。本应用说明中提供的数据说明了可以从使用SEC-TD系统中获得的令人信服的信息。这些信息，包括单体和配合物的分子量和大小，以及蛋白质结构数据，极大地有助于阐明这些多蛋白信号通路背后的机制和特征。

本应用说明中包含的工作在以下出版物中进一步描述:生物化学，(2010)Vol.49, p.318-328;生物。化学学报，(2011)Vol.286, p.16997-17004;生物。化学。(2011)第286卷，第38833 - 38843页;BMC Biochem (2011) Vol.12, Issue 61。

参考文献

1. Karst等(2010)。钙调素诱导百日咳博德氏菌腺苷酸环化酶毒素催化结构域的构象和水动力学变化。生物化学，(2010)Vol.49, p.318-328。
2. Sotomayor Perez等人(2011)。钙诱导的内在无序重复毒素(RTX)基序折叠通过蛋白质电荷和寡聚态的变化。生物。化学。第286卷，第16997 - 17004页。
3. Nickerson等人(2011)。分泌素PulD蛋白的外膜靶向依赖于一个专用伴侣的无序结构域识别。生物。化学。(2011)第286卷，第38833 - 38843页。
4. Benaroudj等人(2011)。分枝杆菌ClpP1和ClpP2的组装及蛋白水解加工。BMC Biochem (2011) Vol.12, Issue 61。