测量外来体稳定性与纳米粒子跟踪分析|莫尔文Panalytical - 188bet金宝搏手机网页,188金宝搏备用

纳米粒子跟踪分析(NTA)可用于研究液的稳定性,并确定适当的储存条件下聚合形成的可能性较小。这里,LM10是用来测量的大小和浓度液后存储在两个不同的温度下,4°C和室温。

介绍

研究细胞外囊泡是一个领域,已经成为近年来激烈的学习和研究的主题。这些囊泡显然是在广泛的原核和真核生物无处不在,人们相信他们有一个宽的作用在许多生理和病理过程。他们通常被描述为液从细胞内体或微泡产生,由细胞膜出芽。细胞的起源、结构、功能和特征仍然是有争议的问题。也讨论研究社会的这种囊泡的大小虽然液同意小(通常直径100纳米或更小),同时微囊泡更大(通常描述为直径1µm)。

同时研究继续提供洞察的作用和潜在的临床联系这些囊泡,重要的是要理解任何样品的稳定性研究,以确保任何差异是真正应由试验条件和没有任何样本本身固有的不稳定性。

在这里,我们描述了使用纳米粒子跟踪分析(NTA)的大小和浓度测量液时,在室温下储存在4°C和5天。

纳米粒子跟踪分析(NTA)概述

NTA利用光散射和布朗运动的性质,以获得样品的粒度分布在液体悬浮。一束激光通过样品室,和粒子悬浮在这个波束散射光线的路径以这样一种方式,他们可以很容易地通过20 x放大可视化显微镜上安装一个摄像头。相机,以大约每秒30帧(fps),捕获粒子移动的视频文件在布朗运动的视场内大约100μm x 80μm x 10μm(图一)。

图一:光学配置用于NTA的示意图。

粒子的运动捕获在一帧一帧的基础上。专有NTA软件同时识别和跟踪每个观察粒子的中心,并确定每个粒子的平均距离感动在x和y的飞机。这个值允许粒子扩散系数(D_t)来确定的,如果样品温度和溶剂粘度η是已知的,sphere-equivalent水动力直径,d,粒子可以确定使用Stokes-Einstein方程(方程1)。

方程1

K_B是玻尔兹曼常数。

NTA不是一个整体技术询问大量的粒子,而是每个粒子大小的分别,不考虑别人。NTA所产生的大小分布配置文件的一个示例如图B。

图B: NTA所产生的大小分布配置文件的一个示例。模态的大小对于此示例是发现约70海里,与较大的颗粒大小也在场。

此外,测量粒子的运动在一个固定的视野(大约100到80年μmμm)被一束大约10μm深度。这些数字让样品的散射体积估计;通过测量粒子的浓度在这个视野和推断更大的体积可以达到每毫升浓度估计的粒子对于任何给定的类或整体总大小。

材料和方法

设备:

两个NanoSight LM10 HSB系统被使用,配备sCMOS相机和波长405纳米的激光。分析用2.3.5 NTA软件。

材料:

冻干液从人类尿液和血浆被储存在4°C,直到需要。
磷酸缓冲盐(PBS)(技术)储存在4°C到需要和检查particle-free之前使用。

方法:

100年urine-derived液囊最初resuspendedµL PBS和混合吸量10倍。增加了900µL PBS和示例用移液器吸取混合。液被转移到另一个管包含19个毫升PBS轻轻地倒混合。最后,10毫升的这个示例被转移到一个干净的管和放置在4°C (exo4_U),直到需要同时剩余的样本保持在室温(20 - 22°C) (exoRT_U)。

等离子体提取液在类似的方式准备(exo4_P和exoRT_P)。

后立即准备,大约700的µL exoRT_U样本加载到激光样品室用1毫升硅油免费注射器。样品室被加载到工具。相机级别被设置为16和图像调整粒子成为关注焦点。三个60秒的视频被抓获,推进样品大约100µl之间测量。样品,样品室之间被冲洗清洁用大约5毫升PBS。样本测量如上所述在孵化时间为0,60岁,120年,180年和300分钟,24小时和5天。

exo4_U样品,相机级别设置为16和视频捕获,在孵化前乘以上述。

后立即准备,大约700的µL exoRT_P样本加载到激光样品室用1毫升硅油免费注射器。样品室被加载到工具。相机级别被设置为13和图像调整粒子成为关注焦点。图像的对比进一步增强使用相机的直方图和阈值设置显示在表1。三个60秒的视频被抓获。随后的如上所述测量(0,六十,120,180,300分钟,24小时,5天。Exo4_P样本以相同的方式使用相机水平13。

所有样本视频离线分析所有的视频已被抓获。对于urine-derived液囊,所有视频分析使用检测阈值的4或5。plasma-derived液囊,检测阈值4用于孵化60分钟或更少的时候,检测阈值6之间的孵化时间120分钟和24小时,孵化和检测阈值3的5天。大小分布概况和浓度数据收集样品。

结果与讨论

等离子体和urine-derived液衡量NanoSight LM10仪器获得粒度分布概况。在零时刻的数据显示在图Ci为等离子体和人民共和国尿液液,与粒子的图像也显示。

图C:初始大小分布配置文件(意思是,SEM n = 3)和粒子图像plasma-derives(我)和urine-derived液(ii)。

PBS-exosome悬浊液适度多分散的,如预期中生物样品的性质和加工使用的描述方法。模态峰值约90海里,然而小山峰140纳米左右,200 nm和300 nm也见过。

悬浮液的浓度和模态大小的外来体从尿液和血浆和在室温下储存在4°C或如图d . 5天阶段期间似乎很少变化的大小urine-derived外来体人口在存储温度,然而plasma-derived液囊的大小似乎略微减少了在第五天(7200小时)。液的浓度都来源显示在测量期间的减少。这似乎更迅速减少血浆液只有2小时后剩余60%的初始浓度。5天之后,只有30%的起始浓度测量。尿液的浓度似乎相当稳定长达3小时,但跌至50%的浓度在24小时内开始。样品的粒度分布配置文件没有显示粒子的增加规模更大,因此损失在浓度很可能由于液降解成小碎片(25岁以下海里)低于检测大小的仪器。

图D:模态数据大小和浓度对等离子体和urine-derived液对各种孵化时候储存在4°C或在室温下。

NanoSight NTA启用快速评估的大小和浓度测量液以确定其稳定PBS-suspension在室温和4°C,由研究常用温度时进行各种与这些样本化验。样品液从尿似乎更稳定的大小和浓度剖面从等离子体相比,显示一个近似浓度降低50% 2小时后储存在温度。这种损失明显等离子体的完整性测试液为研究潜在后果,因为许多研究使用液需要孵化的步骤在这个时间框架。它还表明,存储在4°C没有提供额外的好处在室温下储存。总体而言,这些液的数据表明,任何操作(标签、染色等)应尽快完成,甚至温和的存储时间可以有不利影响他们的可测量的浓度。