DLS蛋白质治疗配方:浓度效应和粒子的相互作用|莫尔文Panalytical

浓度的影响效果和粒子的相互作用在DLS结果讨论的例子增加样品的浓度。路线图提出了识别和区分不同类型的浓度的影响,可能会影响biotherapeutic产品开发。(胶体稳定,维里效果,水动力相互作用参数,动态德拜情节)

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执行概要

动态光散射(DLS)是一种分析技术用于测量蛋白质配方在低聚物的粒度分布和亚微米大小范围约1海里µm 1。DLS在生物制药行业的流行是它的结果工作尺寸和延长样品浓度范围宽,以及它的低容量的要求。说完这些,与应用程序的挑战仍然DLS蛋白质治疗配方是围绕着数据的解释。白皮书在这个由四部分组成的系列中,周围的常见问题和问题原则,讨论了DLS数据的测量和分析,以帮助减少所需的时间,获取和解释DLS数据的复杂性,在整个开发过程是至关重要的。在这第二个系列的白皮书,我们报道的影响集中在DLS的效果和粒子的相互作用的结果,并提供一个路线图识别和区分每种类型的浓度效应。

动态光散射

动态光散射(DLS)是一种分析技术中使用bioapplications测量粒度分布在低聚物和亚微米大小的范围。光散射粒子从一个解决方案将随时间波动,由于布朗运动或扩散。DLS测量,散射强度波动相关在时间跨度小,收益率分布的扩散系数计算粒度分布。

从历史上看,DLS测量一直局限于稀溶液的分析,结果发表在无限稀释和意想不到的极限(或解释的)浓度的影响被丢弃到所有类别的“粒子的相互作用”。然而,现代DLS系统可以提供扩散系数的测量样品在非常高的浓度,甚至高浊度或乳白光的程度,和这些系统的广泛使用在bioformulation市场呈现通用原理无法接受“粒子的相互作用”。事实上,现在bioformulators量化测量粒子的相互作用的DLS相互作用参数(k_D(B)和第二维里系数₂₂),然后使用这些属性来筛选biotherapeutic候选人和随后的稳定条件。

当探索样品浓度的影响在DLS bioformulations分析,有四个问题需要考虑:多重散射,限制扩散,可逆self-association和静电排斥。这些影响可以被识别的过程中浓度DLS实验。

浓度的影响

多次散射

随着样品浓度的增加,散射光子的概率将与另一个高分子rescattered增加(图1)。这种二次散射效应被称为多重散射。

图1:多次散射示意图。

多次散射过程中可以很容易地确定一个DLS稀释实验。多次散射的症状包括以下几点:

随着样品浓度的增加,

散射强度会降低,由于减少光散射检测器的方向与每个二次散射事件。
相关曲线的截距将减少,减少由于测量散射强度。
相关曲线最初将衰减快,但往往与一个小斜坡,由于随机性的多次散射事件。

从尺寸测量的角度来看,后者是最重要的。样品展示多次散射,样品浓度的增加将导致一个明显的减少意味着大小和经常多分散性明显增加或分布宽度。

图2显示了一个示例的多次散射的影响为聚乙二醇biotherapeutic DLS的结果。ultra-dilute条件下(< 0.01毫克/毫升),低散射强度导致减少相关图拦截,以及增加明显的多分散性分布。~ 0.01毫克/毫升的稀释政权2毫克/毫升,预期的增加,散射强度与样品浓度观察,与相关图截取所需的地区~ 0.9。的多次散射地区> 2毫克/毫升,浓度的增加会导致降低相关图拦截,散射强度,明显的大小,以及增加明显的多分散性。

图2:多次散射对聚乙二醇biotherapeutic DLS的结果。

发生多次散射的浓度取决于粒子被测量的大小。不幸的是,没有明确的描述样本之间表现出只有单一的散射和那些表现出多重散射,而是一个灰色地带,多次散射的大小就足以影响后来的尺寸计算。

分散,高度集中限制,光子可以被认为通过样本进行“随机漫步”。根据松树和韦茨(第十六章“动态光散射:方法和一些应用程序“温。布朗,1993),多次散射的扩散限制是由光子平均自由程,或平均光子传输的距离在样品之前遇到一个散射粒子。利用米氏理论,可以计算平均自由程时,粒径,粒子的折射率和分散剂,激光波长,和样品浓度都是已知的。平均自由程测量然后定义&浓度大小依赖的最小粒子分离距离的单散射样品。图3显示了最大样本浓度的大小依赖单一使用波长633纳米的激光散射DLS,水蛋白系统。

图3:大小依赖单一散射DLS的最大样品浓度。

对于典型的蛋白质样品直径< 20 nm,最大浓度的单散射超过200毫克/毫升。对于较大的骨料和其它生物聚合物,最大浓度迅速下降,水平在0.5毫克/毫升或大于0.05 w %粒子直径约200海里。

现代后向散射系统如Zetasizer Nano通常可以弥补细胞壁附近的多次散射效应通过测量,从而减少散射中心和探测器之间的距离。后向散射系统可以增加单散射的最大浓度高达20倍。说完这些,后向散射技术非常适合乳白色的或不透明的样品,在散射强度足够大,呈现耀斑噪声无关紧要。然而,为无色透明biosamples燃除的细胞壁可以很显著的事实呈现足够大的细胞壁测量问题。

限制扩散

布朗运动和扩散是热驱动的结果与高分子溶剂分子的碰撞。布朗运动阻力是由周围的介质的粘性阻力,因此样品粘度纳入Stokes-Einstein方程用于计算水动力测量扩散系数的大小。

从历史上看,DLS稀溶液条件下进行了测量,分散剂粘度参数用于介质的粘性阻力。随着样品浓度的增加,其他大分子将传授向周围介质粘性组件(图4)。这种类型的浓度效应被称为限制扩散。

图4:示意图描述浓度限制扩散效应。

限制在DLS稀释扩散效应很容易识别的实验。限制扩散的症状包括以下几点:

随着样品浓度的增加,

整个DLS大小分布将转向更大的大小如果使用分散剂粘度,由于未能占行列式大分子浓度对粘度的影响。
因为限制扩散是一个行列式或相加作用,没有形态变化和分布的宽度将观察到的。

不像其他类型的浓度效应,限制使用体积粘性扩散效应可以纠正,而不是分散剂粘度,Stokes-Einstein方程。图5显示了一个这样的例子修正乳剂具有限制扩散效应。粘度稀释条件下,样品可以代表的分散剂粘度、DLS分配没有变化是观察到的相对浓度约为10%。随着浓度的增加,高分子贡献样品粘度增加了DLS的行列式的错误结果,与转向大粒径分布宽度或形态没有变化,如果使用分散剂粘度Stokes-Einstein计算。然而,使用的样本或体积粘性纠正为限制扩散效应,产生结果表明没有任何乳液浓度的影响。

图5:体积粘性修正为乳剂具有限制扩散效应。

维里影响

2^nd维里系数(B₂₂)是一个热力学参数代表之间的双向互动潜在bioformulation邻近的蛋白质。而潜在的交互将包括所有类型的相互作用,静电相互作用对蛋白质公式往往占主导地位。因此,他们相对容易识别研究对DLS测量浓度的影响。

负维里系数值是指示性的吸引作用,研究表明强烈的经验B22之间的相关性和蛋白质聚合速率和溶解度。正维里系数值表明排斥相互作用,与大分子在self-association倾向于溶解。

有吸引力——可逆Self-Association

蛋白质与负维里系数值往往会表现出可逆self-association——可逆稀释导致分裂。这种类型的浓度效应通常被称为一个有吸引力的维里效果,在高分子喜欢self-association溶解。DLS不能解决低聚物的物种时,R⁶依赖的散射使DLS非常敏感的细微变化低聚物的分布。这样,有吸引力的维里影响DLS稀释实验期间很容易识别。有吸引力的维里影响的症状包括以下几点:

随着样品浓度的增加,平均分布的大小和宽度增加时,由于低聚物的物种的形成。

图6显示了DLS稀释抗体样本的结果表现出可逆self-association或有吸引力的维里效应,体积粘性修正后限制扩散效应。虚线代表斯托克斯半径,定义为无限稀释的水力半径的限制,即在缺乏浓度或粒子交互作用。如这个例子所示,样品浓度的增加会导致增加的平均大小和峰宽,表明可逆self-association。

图6:DLS稀释抗体形成的结果表现出可逆self-association或有吸引力的维里的效果。

排斥——静电胶体的稳定性

蛋白质与正维里系数值往往会表现出静电斥力。这个排斥倾向于减少聚合、排斥或正维里系数的影响往往是指示性的胶体稳定性。识别的维里在DLS稀释影响研究为新DLS用户可能会非常棘手。关键是要记住DLS措施粒子运动。例如,考虑以下练习:

从带电粒子的集合,所有相同的净电荷。粒子添加到固定的体积,或粒子浓度增加,颗粒之间的分离距离必须减少。这一行动迫使带电粒子靠近,随后增加相邻颗粒之间的静电斥力。排斥力增加,基线大分子的能量,也会导致他们的扩散运动,增加和减少明显的大小由DLS来衡量。所以对于系统表现出排斥维里效果,希望以下从DLS稀释的一项研究:

随着样品浓度的增加,

大小分布将转向更小的尺寸,由于增加相邻颗粒之间的斥力作用和随后的扩散运动。

峰值形态和宽度应保持相对稳定,自基线增加能源将整个样本平均分配。

图7显示了一个示例的DLS稀释抗体样本的结果表现出排斥维里的影响。预期从上面的练习,DLS峰值大小的变化对小尺寸随着样品浓度的增加,峰值形态没有变化或宽度。

图7:DLS稀释抗体的结果制定具有静电排斥维里效应。

DLS相互作用参数(k_D)

粒子的相互作用往往是量化使用DLS相互作用参数(k_D),这是来自于一个动态的斜率德拜情节浓度依赖的测量扩散系数(D)。正如在本文所讨论的,经验DLS相互作用参数之间的相关性和蛋白质聚合率,配方粘度、和API溶解度已报告,和现在的参数是经常用于筛查biotherapeutic候选人和配方的目的,在稀释条件下,高浓度后续稳定的迹象。k的预测价值_D是2的影响的结果吗^nd维里系数(B₂₂)k_D表达式所示表明,D₀自扩散系数是零的极限浓度(C)的斯托克斯半径是派生的,B₂₂是2^nd维里系数,MW分子量,k_f是1^圣订单集中系数的摩擦系数和υ部分具体体积。

D = D₀(1 + k_DC)

k_D= 2 b₂₂米_W——(k_f+ 2υ)

B的影响₂₂在k_D可以观察到在图8中,显示了一个动态德拜情节的比较图6中的抗体制剂(可逆self-association)和图7(排斥维里的影响)。正如前面所讨论的,积极的₂₂值表明对溶解样品的偏好,而不是self-association,而- B₂₂值表明样本self-associate倾向。如动态德拜图所示,抗体形成表现出可逆self-association - k_D价值,而制定表现出稳定的维里有积极影响k_D价值——符合B₂₂预测。