动态光散射(DLS)是一种被广泛接受的技术描述纳米材料的水力半径的暂停。DLS测量的应用分析的蛋白质疗法已大大增加了在过去十年的技术现在被认为是主要分析技术在生物制药领域。DLS制定水平浓度测量的能力,再加上其固有的敏感性大的粒子,使其完美的工具研究蛋白质在溶液中聚合。
拉曼光谱能提供详细的结构蛋白配方信息,通过获得二级和三级结构标记。带强度变化、扩大和变化都可以直接分配到蛋白质结构变化的函数和环境压力。这些结构性变化往往前体聚合,可以直接与拉曼光谱探测。
DLS和拉曼光谱提供的能力来衡量变化大小并发与分子结构的变化。这使得蛋白质聚合和蛋白质结构变化之间的平衡是研究制定环境变化的函数。速率常数为底层的聚合和结构性变化可以直接从结果数据。
聚合和天然态展开蛋白质配方中是至关重要的制造商和病人。产品质量和安全问题既需要了解聚合和仔细监测长期问题可能直接影响配方的稳定性。研究结合DLS和拉曼光谱非常适合探索聚合与蛋白质同时展开的现象,尤其是当这些技术结合在一个单一的工具。
各种机制描述的行为被假定蛋白质配方作为时间的函数,通常在高温与孵化为长期存储代理。这些机制包括表面电荷斥力[1]和部分展开的蛋白质功能区域暴露在溶剂和其他单体。这项工作提供了一个调查在高温孵化时间依赖性的一系列BSA配方不同的博士将监控聚合DLS的进化,而蛋白质展开将跟踪通过拉曼光谱测量二级结构,所有在一个单一的实验。
莫尔文仪器Zetasizer Nano (ZSP)与光纤耦合集成拉曼光谱仪获得DLS(胶体稳定性)和拉曼(构象稳定性)的数据按顺序在一个样本。Zetasizer纳米系统集成了专有的非侵入性的后向散射(上司)探测器技术与动态(DLS),静态(SLS)和电泳(ELS)光散射测量蛋白质从0.15 nm的水力半径5µm,从0.1毫克/毫升浓度> 100毫克/毫升。使用785 nm激发拉曼光谱收集(~ 350 mW)从150厘米1到1925厘米1在4厘米1决议。BSA样本准备在50毫克/毫升浓度在柠檬酸缓冲溶液pH值7.1,5.4,和4.75为了涵盖一系列环境显著高于,略高于,分别和等电点附近。样本整除(~ 120µL)置于一个3毫米石英试管和定位在一个隔间,提供温度控制在0°C到90°C±0.1°C。
图1显示了pH值7.1样本代表性的拉曼光谱在25°C和85°C。相当大的拉曼光谱的变化发生在加热从25°C到85°C,如酰胺我(~ 1650厘米1)和酰胺III(~ 1250厘米1)乐队。这两种功能表明蛋白质的二级结构变化在BSA和证据展开随着温度的增加。同样,大小的数据揭示了一个强有力的转变从~ 7 (25°C) 35 nm (85°C)作为温度的函数。这个结果表明重要蛋白质的聚合55°C。
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孵化温度低于转变温度(Tt)是用于建立一个非平衡状态,聚合是首选和过程可以实时追踪。为此,一系列的温度增加实验是为了建立Tt在感兴趣的小灵通。合成DLS和喇曼过渡曲线是适合每一个公式来确定相应的Tt值。拉曼数据,该地区从1600厘米1到1750厘米1孤立,酰胺我峰值的位置决定通过乐队的质心(CoM),并被用作蛋白质展开的一项指标。物理机制被认为是α-helixβ-sheet蛋白骨干的转换。图2显示的结果转换为每个配方。
在图2中描述的结果显示T的变化t的函数博士感兴趣的是不同样本之间的转变温度的变化:pH值5.4示例显示最高的Tt,pH值4.7显示最低的。插图图显示了pH值4.7全程光谱范围请预测样本,并预测α-helix和BSAβ-sheet结构作为温度的函数。α-helix的数量迅速减少视为BSA的转变温度,表明该组织正在上演。表1总结了结果size-derived Tt,以及Tt计算从我和酰胺三世光谱区域的酰胺。
因此,Tt对BSA不同59°C到65°C,取决于解决方案博士也是有趣的从表1是聚合的发病预测pH值4.7样本大小的结果是3°C低于预测展开的光谱的结果。这是因为蛋白质溶液pH值接近的等电点(π),在charge-charge蛋白质单体之间的斥力是不存在的。蛋白质实际上开始聚集在它开始之前展开,而不是行为的其他缓冲区。
| BSA | 大小(nm) | 酰胺我(°C) | 酰胺III (°C) |
|---|---|---|---|
| pH值7.1 | 64.5 | 64.8 | 64.6 |
| pH值5.4 | 64.4 | 66.1 | 66.6 |
| pH值4.7 | 56.5 | 59.6 | 59.6 |
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结果总结在表1中显示60°C作为起点来检查这些BSA的聚合动力学公式。为此,每个配方孵化60°C, DLS和拉曼数据收集连续每5分钟。选择60°C确保孵化发生略低于TtBSA的酸碱7.1和5.4的配方。BSA实验进行了60°C的pH值4.7显示即时降水的片状的白色物质- BSA在这些条件下的聚合速度比可以测量。图3总结了拉曼光谱数据和DLS数据收集的pH值5.4和7.1配方60°C。
注意在图3的实质性差异的行为的配方。pH值5.4(左面板),BSA配方显示几乎没有光谱变化后7.7小时孵化60°C,但显示了一个大的变化大小从报道DLS(左插图)。这一结果表明,聚合接近π的结构性变化发生在缺乏蛋白质,类似的结果在π(pH值4.7)。BSA在pH值为7.1(右面板)显示大量的光谱变化和较低聚合度(右插图)后7.7小时孵化60°C。进化的拉曼光谱显示α-helixβ-sheet转换,追踪蛋白质作为孵化所得的演变。应该注意的是,7.7小时后观察到的大小变化从7到35 nm (pH值7.1)和450海里(pH值5.4)。此外,展开和大小动力学密切跟踪另一个pH值7.1样本(下面的图4),表明聚合和蛋白质发生并发点远离π。
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因此,对于两个样品测量转变温度以下,我们看到独特的行为。在pH值为7.1,远离π,BSA的Z-average大小的演变轨迹的蛋白质。有趣的是,这强烈表明,蛋白质是展开更大的规模,但明显不是聚合。它还可以显示一个相对较小的聚合度,但光谱之间的相似之处和大小趋势是惊人的。附近的pH值5.4,π,蛋白质不展开,但聚合到非常大的规模。
图5显示一组类似的结果BSA在pH值7.1和4.7配方50°C孵化。
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结果孵化后50°C没有可观察到的变化,pH值7.1样本。pH值4.7示例显示了一个大幅增加Z-average大小(~ 20 nm 20小时后孵化),但没有明显的拉曼光谱的变化。缺乏显著的变化并不出人意料,因为这个温度大大低于Tt两种剂型。结果也表明,聚合发生没有pH值4.7配方的结构性变化,类似于pH值5.4配方60°C孵化。
进一步探索聚合动力学、酰胺的CoM我乐队的计算拉曼光谱,这应该作为BSA的展开程度的指示。图6显示了CoM的结果分析。
酰胺我乐队的发展随着时间的推移,给出了一个明确的BSA在等温孵化的展开。pH值7.1 60°C样品表明拉曼移近1.5厘米1超过7.7小时,最大的变化在光谱中看到。pH值5.4 60°C示例显示了一个0.25厘米的更温和的转变1,而其他样本显示没有变化的时期。这些结果是在良好的协议与塔基的早期研究,等。[2]。应该注意的是,pH值4.7 50°C的结果是0.35厘米所抵消1和pH值7.1 50°C样品是1厘米所抵消1为清晰。每个乐队的适合一个指数动力学模型提供的速率常数展开,k,总结在表2中。
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类似的分析可以进行每个配方Z-average尺寸数据,如图7所示。
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pH值7.1 60°C样品结果前面所提到的,大小和显示适度的变化被认为是由于BSA展开。pH值5.4 60°C样品显示规模最大的变化由于BSA的聚合,而pH值4.7 50°C样品显示大小略有增加。pH值7.1 50°C显示大小没有变化的报道。这些曲线也被安装在一个指数和总结在表2中。
速率常数来源于DLS和拉曼数据完整的描述聚合和展开动力学。远离π,如示例7.1 pH值、BSA T附近展开相对迅速t(60°C)的拉曼光谱。并发,但是小,大小也看到的变化,表明BSA正在上演,而不是聚集在这些条件下。检查进一步从Tt(50°C)为同一配方没有大小或结构的变化,本质上和采取的解决方案是在这些条件下稳定。在pH值为5.4,接近π,BSA是快速聚合,慢展开接近Tt(60°C)。在pH值为4.7,在π和T以上t(60°C), BSA总瞬间。下面Tt(50°C)在pH值4.7 BSA缓慢聚合,没有可测量的光谱变化。因此,BSA的有效电荷趋于零,蛋白质是免费的快速聚合,似乎这样做。进一步展开的蛋白质是首选的等电点。
| pH / T | 大小 | 酰胺我 |
|---|---|---|
| k / s1 | k / s1 | |
| 5.4/60°C | 6.22 x104 | 8.66 x105 |
| 7.1/60°C | 1.53 x104 | 1.08 x104 |
| 4.7/50°C | 1.78 x109 | - - - - - - |
| 7.1/50°C | - - - - - - | - - - - - - |
能够快速收集大小和结构数据覆盖范围的BSA配方提供了一个明确的蛋白质的聚合动力学。远离π,蛋白质单体由表面电荷排斥,不聚集,即使明显的演变。π是接近和表面电荷减少,聚合成为占主导地位的行为,用一把小程度的蛋白质展开。π,聚合似乎完全主导,没有可见的蛋白质。
拉曼光谱与DLS为了测量已成功结合蛋白质结构变化的并发与蛋白质水力半径的变化。结合的方法确保样品在相同条件下测量在一个平台,保证测量的最可能的实验条件。这项技术已经证明的能力描述聚合行为和蛋白质展开动力学在一个实验中,导致改善对这两个过程之间的相互作用的理解。此外,对聚合速率常数和蛋白质展开已经从实验结果中直接提取。
莫尔文仪器的生物科学发展倡议(BDI)成立加速创新,开发和推广新技术、产品和能力来解决生物科学市场测量需求得不到满足。
