结合动态光散射(DLS)和拉曼光谱能够提取丰富的化学结构和物理参数从蛋白质浓度低和配方。DLS,用于研究蛋白质大小和拉曼,用于确定蛋白构象,组合成一个单一的仪器监测强调蛋白质样品在相同的条件下。
DLS大小适合测量蛋白质在低浓度(0.1毫克/毫升),而拉曼光谱是适合推导二、三级结构标记更高浓度的蛋白质样品(50毫克/毫升或更大)。实用的感兴趣的领域之一是理解蛋白质的最低浓度,可以使用这些组合分析技术研究。因为DLS是适合分析低浓度样品,这张纸币将概述蛋白质含量最低的实际限制获得拉曼光谱,并确定光谱提供有用的二级和三级结构信息。结果用溶菌酶显示有用的信息从浓度低至3毫克/毫升可以获得,而单克隆抗体样本(mab)可能需要更高的浓度来获得正确的信息结构和热。
的能力总和DLS /拉曼仪器来研究探讨不同浓度的蛋白质样品。DLS,其能力来衡量蛋白质大小,是理想的低浓度样品,而拉曼,以其审问蛋白质二级和三级结构的能力,非常适合于高浓度样品。加入到一个单一的技术技术支持的决心大小和结构在一个体积小样本。然而,由于理想互补技术有不同的浓度,重要的是首先建立上下实际浓度界限为蛋白质样品。这个注意侧重于确定的最低浓度极限研究蛋白质与DLS /拉曼相结合。
莫尔文仪器Zetasizer螺旋(z螺旋)集成的光纤耦合拉曼光谱仪Zetasizer Nano ZSP提供DLS(胶体稳定性)和拉曼(构象稳定性)的数据按顺序在一个样本。Zetasizer纳米系统集成了专有的非侵入性的后向散射(上司)探测器技术与动态(DLS),静态(SLS)和电泳(ELS)光散射测量蛋白质的水力半径0.15 nm - 5µm,从0.1毫克/毫升≥100毫克/毫升。使用785 nm激发拉曼光谱收集(~ 280 mW)从150厘米1- 1925厘米1在4厘米1决议。示例整除(~ 120µL)放置到一个3毫米石英试管和定位在一个温度控制舱提供温度控制在0°C - 90°C±0.1°C。热坡道收集拉曼和DLS数据进行的研究是在一系列预定义的0.1°C - 5°C步进式增量。等温孵化研究由收集一系列拉曼和DLS数据在一个预定义的时间间隔在所需的温度点。
拉曼光谱数据采集条件优化低浓度蛋白质样品来确定实际检出限获得拉曼光谱对蛋白质疗法。两个样品进行了分析,溶菌酶和马伯,在多个浓度。二次结构标记,包括酰胺(1600厘米1- 1700厘米1)和酰胺三世(1200厘米1- 1350厘米1),观察到,随着三级结构标记,如酪氨酸(酪氨酸)~ 830厘米1和色氨酸(Trp) ~ 1550厘米1在热斜坡实验。这些标记的变化表明加热期间改变蛋白质的结构,因此能够检测本质上重要的是研究蛋白质结构的任何更改。
这个应用程序注意集中在确定蛋白质的最低浓度,可以使用联合DLS研究/拉曼仪器。因为DLS是理想的低浓度样品(在以前的应用程序中注意解决),这里大部分的努力一直被应用在优化拉曼采集参数。到一个特定的限制(饱和探测器),有一个积极的线性积分时间和拉曼信号之间的关系,和一个平方根co-adds的数量和拉曼信噪比之间的关系。因此,提高拉曼信号从低浓度样品少了喇曼散射粒子可用,可以增加积分时间尽可能长时间和增加co-additions多个扫描(co-adds)。然而,为了使实验*实际,收购时间保持在或低于30分钟为溶菌酶和马伯低浓度样品。更高浓度样本用于建立预期的蛋白质结构的变化。下面是一个总结的采集参数用于收集溶菌酶和马伯数据(表1)。
| 样本 | 积分时间(s) | Co-adds (#) | 拉曼收购时间(s) / T | 总收购时间(分钟)/ T |
|---|---|---|---|---|
| 35毫克/毫升溶菌酶 | 15 | 10 | 150年 | 5.5 |
| 12毫克/毫升溶菌酶 | 30. | 10 | 300年 | 8 |
| 3毫克/毫升溶菌酶 | 40 | 40 | 1600年 | 30. |
| 50毫克/毫升马伯 | 20. | 10 | 200年 | 6 |
| 10毫克/毫升马伯 | 20. | 10 | 200年 | 6 |
| 5毫克/毫升马伯 | 25 | 40 | 1000年 | 20. |
热增加实验进行审问3毫克/毫升,12毫克/毫升,35毫克/毫升样品溶菌酶在柠檬酸缓冲液pH值4。最高浓度样本作为参考点的低浓度样品的比较。
35毫克/毫升溶菌酶溶液的光谱25°C(由红色光跟踪)和90°C(由深红色跟踪)包括(图1)。感兴趣的一些蛋白质标记突出显示,表明二级和三级结构在温度变化的斜坡实验。变化是明显的酰胺(~ 1600厘米1- 1700厘米1)、酰胺III(~ 1200厘米1- 1350厘米1),α-helix骨骼(930厘米1- 950厘米1)地区,以及Trp 760厘米1。
DLS尺寸数据(强度分布)是高浓度溶菌酶还包括样本(图1 b)。不出所料,结果表明,随着温度的增加,溶菌酶的大小增加。这表明蛋白质展开(并可能聚合)发生随着温度的上升,这是一致的光谱数据表明,蛋白质结构的改变随着温度的增加。此外,质心(COM)转变温度酰胺我包含峰值(图1 c)。随着温度的增加,COM转向更高的波数,表明结构正在从α-helixβ-sheet丰富随着温度的增加。在这个相对较高的浓度,光谱和大小转换明显,拉曼数据可以用于蛋白质检测和表征,可以提取和转换信息。这些信息是用来比较低浓度数据。
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提高信噪比低浓度样品的拉曼数据,必须使用更长的积分时间和更多的积累比浓度越高所需样品。这导致每个光谱数据收集时间更长。数据积累时间只要30分钟为一个温度点(DLS和拉曼)被用于溶菌酶浓度最低的样品(表1)。虽然这将导致一个更长的实验,它允许识别的二、三级结构标记在拉曼数据,在某些情况下,允许热应力产生的光谱变化的决心。
拉曼光谱、DLS强度分布和酰胺我COM转变为高(35毫克/毫升),中等(12毫克/毫升)和低(3毫克/毫升)溶菌酶浓度比较如图2所示。
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35毫克/毫升的拉曼光谱(红线)数据是最吵闹的,尽管数据从3毫克/毫升浓度溶菌酶样品(蓝线)是最吵闹的,和12毫克/毫升样品(黑线)落在中间的两个(图2)。即使增加了收购倍,低浓度样品的信号比两个吵着更高浓度样本。DLS的强度分布数据表明,蛋白质分子在溶液中都在25°C ~ 4纳米(图2 b)。尺寸数据和光谱数据之间的相似性在起始温度这三个浓度表明DLS /拉曼检测可用于溶菌酶浓度低至3毫克/毫升。
进一步评估的能力DLS /拉曼仪器来检测低浓度蛋白质样品,酰胺的COM转变我包含峰值浓度(图2 c)。红色的线条代表的高浓度样品显然展品转向更高的波数熔化温度为71°C(由拟合曲线的乙状结肠)。12毫克/毫升数据显示类似的过渡(黑色三角形覆盖的红色圆圈);然而,熔化温度不能确认这个样品因为温度增量5°C的步骤,而不是1°C步骤(为了避免可能的动力学效应)。之间的相似趋势是明显的。3毫克/毫升COM变化不明显,无法证实。由于时间所需的测量,数据只是收集到80°C,而不是90°C与样品浓度越高,观察,没有尖锐的过渡与样品浓度越高。更逐渐过渡可能发生在较低的温度,但它是不可能知道这个转变是蛋白质结构变化的结果仅仅是由于增加的温度,或如果它是温度升高的结果结合更多的时间长度在蛋白质溶液暴露在高温(由于长时间数据采集在每个温度增量)。
另外比较高浓度和低浓度样品是由使用内部请模型来确定5浓度的溶菌酶的二级结构组成(图3)。
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四个不同的二级结构组成:α螺旋、β,β,和随机线圈,预计每个溶菌酶的样品。对于所有浓度,α螺旋比例是最高的,平均百分比44.0%±2.0%。这个值同意文献报道的溶菌酶解附近的pH值4[1,2]。随机线圈组成,28.0%±2.0%,报告第二浓度最高,其次是β(18.0%±0.3%),和β表(6.0%±1.0%)。虽然细微差别(报告为标准偏差)是观察之间的不同浓度,浓度的值是非常相似的,再次表明低浓度样品的拉曼收集的数据是一个很好的溶菌酶的表达。
溶菌酶热增加研究的结果表明,浓度低至3毫克/毫升可以使用拉曼光谱检测/鉴定,但对于任何信息关于构象变化在加热期间,更高浓度的样品可能是必要的。
类似于溶菌酶,高浓度(50毫克/毫升),中浓度(10毫克/毫升),和低浓度(5毫克/毫升)样品的马伯使用DLS /拉曼的组合进行了研究。热增加实验从25°C - 90°C 0.2°C - 0.5°C所有浓度的步骤。高浓度数据收集,用于比较低浓度样品数据。
高浓度样品的拉曼收集时间~ 3.3分钟温度增量(表1),这个集合时间导致拉曼光谱具有高信噪比。拉曼光谱包括30°C和80°C(图3)。在这里,说明蛋白质结构变化的波数变化不太明显比模型蛋白,溶菌酶,研究了以上。然而,在分析,很明显,三级结构变化时发生热应力下的蛋白质溶液。在这种情况下,三级结构变化比二级结构变化更加突出。其中的一些二、三级结构变化突出显示。
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评估马伯数据在低浓度被证明是更加困难比分析低浓度样品溶菌酶,甚至更加困难比高浓度马伯样本。图4包含光谱从50毫克/毫升(红线),10毫克/毫升(黑线),5毫克/毫升(蓝色)马伯样品25°C。最高浓度样本结果的噪声频谱,而低浓度的数据样本是最吵了。马伯样本,二级结构不会改变显著,所以小三级结构的变化进行评估。低浓度的样品,它是更难识别标记。兴趣是强调的一个重要区域,展示了难以看到标记,在这种情况下,酪氨酸,在830厘米1- 855厘米1的范围内。结果表明,低浓度数据比高浓度吵着数据,类似于溶菌酶样品的结果。
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进一步建立数据之间的高质量和低浓度样品不同,COM转变为酪氨酸画标记在50 mg / mL, 10毫克/毫升,5毫克/毫升样品(图4 b)。一个重大转变是观察到50毫克/毫升的解决方案(红色线),估计熔化温度为69°C通过曲线拟合的乙状结肠。10毫克/毫升的数据还显示了一个类似的转变温度的增加(黑线)。然而,通过观察COM 5毫克/毫升的数据样本,没有一个明显的转变在COM温度的增加。信号是由噪音,即使积分时间的增加。基于信息从马伯获得样品在不同浓度,浓度低至5毫克/毫升可用于检测的样本,但是对于任何类型的热转换的说明,浓度需要至少高达10毫克/毫升。
DLS /拉曼的组合可以很容易地用于说明蛋白质的构象(拉曼)和大小(DLS)当接触压力变化。拉曼检测的浓度下限,通常只用于研究高浓度样品,已经被执行评估这里热增加实验。模型蛋白,溶菌酶浓度低
可以学习3毫克/毫升,二、三级结构的识别标记。单克隆抗体,另一方面,更稳定的二级结构,更容易表现出只有三级结构变化。这些标记可以发现在低浓度
5毫克/毫升,但对于任何过渡信息,需要浓度高达10毫克/毫升。这些互补技术的结合可以使蛋白质的理解展开和聚合通道在低和高的浓度。
莫尔文仪器的生物科学发展倡议(BDI)成立加速创新,开发和推广新技术、产品和能力来解决生物科学市场测量需求得不到满足。
