相结合的动态光散射(DLS)和拉曼光谱能够描述丰富的化学结构和物理参数的治疗性蛋白质。拉曼光谱同时获取蛋白质二级结构标记(酰胺我和III)和三级结构标记(芳香族侧链、二硫键、氢键本地疏水性)。这些标记可以监控受控条件下测定的光谱峰值的位置,形状,和/或强度。拉曼能够使这些结构在配方浓度决定,50毫克/毫升或更高版本,而不是在传统的方法所需的稀释浓度,即通常小于几毫克/毫升圆二色性(CD)。
DLS使用后向散射检测能够测量蛋白质在高浓度的水力半径(超过50毫克/毫升)。这项技术是基于光散射,散射强度尺度与r6,敏感聚合物的形成。因此,改变大小分布和多分散性的函数各种扰动(温度、pH值、盐浓度,等等)可以监控,使推导过程的蛋白质相互作用和动态信息,即kD、放松。
这两种技术结合成一个单一的系统允许的测量大小和结构相同的条件下从一个小体积样品。这种结合方法的独特之处在于,它可以显示,例如,如果一个蛋白质结构改变了然后聚合,聚合没有结构性变化,或改变结构和保持un-aggregated。因此能够提供有用的见解聚合形成的机理。
聚合和天然态展开蛋白质配方中是至关重要的制造商和病人。产品质量和安全问题既需要了解聚合,并仔细监测长期配方稳定性相关的问题。拉曼光谱和DLS完全适合探索蛋白质的聚合。拉曼光谱获取蛋白质的信息展开通过监测分子振动的变化而发生的变化的蛋白质的二级和三级结构。DLS,另一方面,技术可以用来确定治疗的水力半径蛋白质在溶液中,样本的多分散性,同时样品的交互。通过结合这两种分析方法集成到一个单一系统中,大量的化学结构和物理参数可以确定。蛋白质的二级和三级结构,熔化温度(T米),出现聚合温度(T发病),转变焓值都可以导出,以及聚合的倾向,蛋白质的溶解度,和潜在的高粘度浓度制定。结果从DLS的互补性和拉曼光谱在同一样本可以提供独特的见解聚合和演变的机制。
实现并发DLS和拉曼测量,莫尔文仪器Zetasizer螺旋(z螺旋)集成的光纤耦合拉曼光谱仪Zetasizer Nano ZSP提供DLS(胶体稳定性)和拉曼(构象稳定性)的数据按顺序在一个样本。Zetasizer纳米系统集成了专有的非侵入性的后向散射(上司)探测器技术与动态(DLS),静态(SLS)和电泳(ELS)光散射测量蛋白质从0.3 nm的水力半径10µm,在浓度从0.1毫克/毫升到100毫克/毫升,或者更多。使用785 nm激发拉曼光谱收集(~ 280 mW)从150厘米1到1925厘米1在4厘米1决议。样本整除(~ 120µL)引入到温控样品室使用石英试管3 mm路径长。样品室温度可以设置从0°C到90°C±0.1°C。热坡道收集拉曼和DLS数据进行的研究是在一系列预定义的温度增量,而等温孵化实验是由收集DLS和拉曼数据在较低的温度下,迅速提高温度,收集大量的拉曼和DLS数据在一段时间温度越高。
拉曼光谱是一种有效的方法来确定蛋白质的二级和三级结构特点。各种二级结构标记,包括酰胺
(1600厘米1- 1700厘米1)、酰胺三世(1200厘米1- 1350厘米1),α-helix骨干(930厘米1- 950厘米1)可以被监控。这些地区的任何变化表明蛋白质的二级结构变化。此外,拉曼光谱是高度敏感的对称振动模式芳香族侧链,即苯丙氨酸(检),酪氨酸酪氨酸和色氨酸(Trp),已被广泛用作探针的蛋白质三级结构。有几种行之有效的和常用的拉曼标记提供了洞察这些芳香族侧链的环境,包括Trp 1550厘米1在850厘米和酪氨酸1。变化在这些领域建议改变当地的亲水/疏水侧链的环境,这是展开的特征。
阐明蛋白质结构变化的能力,拉曼光谱是理想的学习展开的蛋白质。一个已知情况下,蛋白质和总展开是暴露在热应力。包括下面是拉曼光谱的溶菌酶样品使用热暴露在热应力增加实验。图1显示了溶菌酶的光谱样本在20°C(蓝线)和80°C(红线)。
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图1清楚地表明,随着温度的增加,溶菌酶的二级结构(绿色圆圈)的变化。这些变化与峰值变化和/或强度的变化。并发与二级结构的变化改变芳香族侧链(黑圆圈)。这些三级结构标记表明当地水环境变化的侧链,侧链的氢键的变化,和反键角的变化。基于从拉曼光谱中观察到的二、三级结构变化,很明显,溶菌酶接触热应力时正在发生结构性变化。
传统上,DLS只被认为是用于获取大小从低浓度样品的信息,它被广泛应用来确定蛋白质的水力半径解决方案。然而,反向散射探测的包容,在溶液中蛋白质的大小(50毫克/毫升或更高)可以确定。除了尺寸测量,DLS供应信息粒度分布,或多分散性(PDI)的示例,可以用来测量T发病。由于其灵敏度大小,DLS是理想的检测少量的大骨料的解决方案。图2(下图)包括结果牛血清白蛋白(BSA)热增加实验。
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在图2中,Z-averaged大小趋势(蓝线)表明,T发病~ 62°C。量和强度分布(嵌入)显示,随着温度的增加,增加的数量更大的粒子检测仪器;具体来说,有大颗粒的增加在60°C(紫色线,插图)。这些都表明,总量增加开始形成。此外,PDI开始增加早在55°C,表明聚合开始发生在温度。
结合拉曼,以及监测蛋白质结构变化的能力,与DLS、蛋白质及其监控能力大小变化,导致技术适合监测蛋白质展开/聚合途径。例如系统,配方的BSA在柠檬酸缓冲各种小灵通已经用于研究蛋白质之间的联系展开和聚合。样本创建50毫克/毫升浓度在pH = 4.7, 5.4, 7.1,和转变温度(T米)确定为每个进行增加实验。样本然后孵化略低于他们的T米展开应该是首选的国家,但活动缓慢进行。代表结果如图3所示(下图)的等温孵化研究。
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左上角面板显示变化的程度在pH值7.1 BSA样本60°C之间的孵化t = 0(蓝色)和t = 7.8小时(红色)酰胺我乐队和DLS结果(插图)。完整的分析拉曼(酰胺)和DLS数据显示在右上角和左下角的面板,分别。分析揭示了显著pH-dependence BSA展开和聚合的行为。例如,在图3中,右下角的面板的时间依赖性酰胺我乐队和Z-averaged大小是叠加。这张图表明,结构和尺寸变化密切跟踪。它还表明,蛋白质的结构展开追踪的拉曼光谱的结果在一个更大的BSA单体(35海里),但这小聚合BSA的发生。观察结果在pH值5.4揭示了一个不同的画面;也就是说,蛋白质的结构变化非常小(~ 0.25厘米1质心变化后7.8小时),但大小变化明显更大的(> 500海里后7.8小时)。pH值4.7的结果,最近的等电点(π),显示一个小变化在大小50°C,和结构没有明显变化。60°C T以上米BSA的pH值4.7,蛋白质沉淀瞬间。这个比赛预期π,附近charge-charge蛋白质单体不存在排斥和总量都是免费的。
拉曼光谱和DLS的结合提供了一个清晰的窗口如何获得结构和尺寸数据可以用来理解流程分析感兴趣的社区。
DLS和拉曼光谱的结合在一个单一的工具允许说明蛋白质结构和规模的变化从一个样本。DLS,衡量蛋白质的能力大小,是蛋白质的良好指标聚合,和拉曼光谱,它能够探测蛋白质的二级和三级结构也是一个很好的指标蛋白展开和潜在的聚合。相结合,这些技术可以提供一个独特的洞察展开/聚合途径,提供关键的特征信息。
莫尔文仪器的生物科学发展倡议(BDI)成立加速创新,开发和推广新技术、产品和能力来解决生物科学市场测量需求得不到满足。
