相结合的动态光散射(DLS)和拉曼光谱能够提取丰富的化学结构和物理信息biotherapeutic配方条件下蛋白质。
动态光散射(DLS)使用的后向散射(上司)检测技术能够测量蛋白质在一个大型的水力半径浓度范围(0.1毫克/毫升到100毫克/毫升)。结果,可以确定,在实际生物制药配方中,体积粘性/限制扩散相互作用参数(kD(B),粒子相互作用参数22)、熔化温度、发生蛋白质聚合温度和焓变过渡到评估胶体的稳定性。
DLS的独特的耦合与拉曼光谱能够同时将胶体参数关联到蛋白质结构在各种压力的情况下,例如,热,制定、化学降解,外在微粒,提高我们理解蛋白质治疗配方。
动态光散射(DLS)是一个主力技术确定水动力直径biotherapeutic蛋白质在溶液中,样品多分散性和示例的交互。拉曼光谱获取蛋白质的二级和三级结构信息通过监测分子振动。通过结合这两种分析方法集成到一个单一系统中,大量的化学结构和物理参数可以确定。蛋白质的二级和三级结构、熔化温度、起始温度的聚合和转变焓值都可以导出,以及聚合的倾向,蛋白质溶解度和潜在的高粘度浓度制定。结果从DLS的互补性和拉曼光谱在同一样本可以提供独特的见解聚合和演变的机制。这里我们描述DLS的效用来帮助理解的胶体稳定性蛋白质疗法。
莫尔文仪器Zetasizer螺旋(z螺旋)集成的光纤耦合拉曼光谱仪Zetasizer Nano ZSP提供DLS(胶体稳定性)和拉曼(构象稳定性)的数据按顺序在一个样本。Zetasizer纳米系统集成了专有的非侵入性的后向散射(上司)探测器技术与动态(DLS),静态(SLS)和电泳(ELS)光散射测量蛋白质的水力半径0.15 nm - 5µm,从0.1毫克/毫升≥100毫克/毫升。使用785 nm激发拉曼光谱收集(~ 280 mW)从150 - 1925厘米1在4厘米1决议。示例整除(~ 120µL)放置到一个3毫米石英试管和定位在提供温度控制的温控室从0°C - 90°C±0.1°C。热坡道收集拉曼和DLS数据进行的研究是在一系列预定义的0.1°C - 5°C步进式增量。等温孵化研究由收集一系列拉曼和DLS数据在一个预定义的时间间隔在所需的温度点。
单克隆抗体在高浓度的制定了近年来在生物制药行业的重视。然而,对于DLS、尺寸测量在制定浓度由多个试验因素是有限的。如图1所示,增加样品的浓度会影响观察到的散射强度,因此大小的决心。影响测量的因素可能包括:多次散射,粘度,积极/消极影响维里,self-association。反褶积的效果允许高浓度样品结果的解释。
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为了更好地理解上述因素对DLS的影响数据,方便孤立地考虑个体效应。表我(下图)总结了预期的变化随着样品浓度的大小,多分散性,和关联函数,建立了校正方法,为每个不必要的因素。
| 因素 | 明显的大小 | 明显的多分散性 | 相关路口 | 校正方法 |
|---|---|---|---|---|
| 多次散射 | 减少 | 增加 | 减少 | 反向散射 |
| 限制扩散 | 增加 | 没有变化 | 没有变化 | 粘度校正 |
| - B22 | 增加 | 增加 | 没有变化 | 没有 |
| 积极的B22 | 减少 | 没有变化 | 没有变化 | 没有 |
图2(下图)演示了粘度校正的效果报告的样本大小。使用水的粘度粘度作为样本的估计结果,明显增加悬浮粒子的大小(蓝色方块)。然而,当真正的本体溶液粘度是用来正确地适应DLS的结果,没有明显的尺寸变化是观察(绿色圆圈)。粒子交互条款包括吸引力/排斥,B22(第二维里系数)和kd(扩散相互作用参数)表示,将在下一节中介绍。应该注意的是,对维里效果,目前没有一个统一的方法来纠正DLS数据。
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静态光散射(SLS)或浊度加上热增加通常都被用作蛋白质配方筛选工具快速稳定。从本质上说,这些方法测量聚合温度T发病。DLS也可以以这种方式使用。图3显示了聚合开始Z-averaged BSA大约是62°C的大小。此外,只要相关图仍然有效,DLS提供大小分布(图3,插入)和多分散性(PDI), SLS只提供的强度。这里显示的大小分布趋势清楚地揭示了第二个峰值的出现在90 nm近60°C。开始从PID温度可能早在55°C,表明聚合可能更早开始。
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能够检测出微量的骨料源于DLS固有的敏感性。图4显示一个简单的混合物的两个粒子直径数量级的差异,更大的50纳米粒子将显示一个散射强度一百万倍5纳米粒子越小。这个推断,即便是一个大粒子和一百万小颗粒在同等强度检测结果!因此,DLS可能是有用的作为骨料的出现最早的探测器。然而,应该注意的是,解决DLS本质上是有限的三倍大小。
尽管T发病首次配方筛选可能就足够了,没有理解蛋白质相互作用可以达到这样的实验,更不用说蛋白质稳定性的预测。最近,更多的注意力都集中在研究分子间参数预测蛋白质的聚合动力学,已成功与B22和kD[1]。一个大型B的积极价值22表明,溶质在self-association喜欢与溶剂,由于强烈的溶质分子之间的静电排斥或溶质和溶剂之间积极的互动。相比之下,大负的B22表明强烈self-attractive系统,粒子更喜欢self-association或聚合完全溶解。
对于DLS, kD可以直接测量和B有关吗22由以下方程[2]:
这里,C是样品的浓度和D指DLS的扩散系数测量。D0是自扩散系数D的值在零浓度)。米w是样品分子量,kf是第一个订单集中的摩擦系数和ν是溶质的分具体体积。
以下实验演示如何应用kD预测一个免疫球蛋白的蛋白质稳定性四个配方。在图5中只有汤2(红圈)有一个积极的kD,表示强烈排斥相互作用的蛋白质样品。其他三个样本显示略- kD。应该提到大积极的kD通常表示强烈排斥相互作用,或积极的B22。然而,当kD接近于零很难直接链接到B22。
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SLS可以测量在一个固定的角度22,和电动电势测量提供相对,总结如表2所示。把所有的信息在一起,可获得全面概要的蛋白质性质预测蛋白质的稳定性。例如,我们将预测,制定2是最稳定的配方免疫球蛋白,同时制定1是最不稳定的。
支持这一预测,热增加实验进行相同的样本集,如图6所示。有趣的是,样本1最低T发病接近66°C,而配方2是最稳定的,没有大的证据总量达到90°C。
| 免疫球蛋白制剂 | B22(105毫升摩尔/ g2) | kD(ml / g) | 负责 |
|---|---|---|---|
| 汤1 | -1.5 | -5.2 | 3.3 |
| 汤2 | 127.5 | 31.9 | 9.7 |
| 汤3 | 10.4 | -9.7 | 5.1 |
| 汤4 | 2.3 | -4.7 | -2.8 |
DLS和拉曼光谱的结合和集成到一个仪器平台提供了独特的分析能力来确定蛋白质的二级和三级结构,熔化温度,和相同的样本大小和发生聚合,在不改变测试条件。在这里,我们描述了DLS的独特的能力,当结合无损后向散射探测器(上司)技术,推导体积粘性/限制扩散相互作用参数(kD(B),粒子相互作用参数22)、熔化温度、起始温度在高浓度配方聚合和转变焓变。随后的研究描述了独特spectra-structure属性,可以使用拉曼光谱相关(理解蛋白质的构象稳定性与拉曼光谱疗法)。未来的研究将报告独特的相关性,可能来源于DLS的组合和拉曼光谱改善动力学的理解,热力学和机制(s)的聚合和关联的特定蛋白质结构主题聚合和配方稳定提高产品知识。
莫尔文仪器的生物科学发展倡议(BDI)成立加速创新,开发和推广新技术、产品和能力来解决生物科学市场测量需求得不到满足。
