5步骤成功的液相色谱法
在过去的几十年里,色谱法大量的发展和进步。精密的仪器已经发明了改善chromatography-based测试的效率,和进步也扩展到软件,获取和处理数据。快速浏览一下这种技术的历史1显示出这个领域的发展;从大型填料塔和移动阶段感动重力,50 mm列挤满了低于µm珠子和移动阶段移动使用强大的泵。
这相当大的跳把技术分析方法的宝座。你可以很容易地找到高效液相色谱设备实验室的所有形状和品牌分析制药、环境和食品样品,由于高效液相色谱法分析复杂混合物的非凡能力,而不需要大量的样品制备步骤。
值得注意的是,液相色谱一词包括一些技术,如薄层色谱法,制备,纸色谱法。本指南重点是高效液相色谱法(HPLC),因为它是最常用的常规测试的技术。如果你了解仪器的原理和性质,但发现测试过程稍微混乱,本指南可以帮助你找到自己的方向在一个快节奏的实验室,利用高效液相色谱经常。
分析高效液相色谱方法对初学者来说是无法避免的。这些方法通常挤满了相关信息和指示的每一步实验。熟悉高效液相色谱方法的格式在实验室里是很重要的,所以你可以很容易地找到你的过程。
大多数书面程序首先介绍或范围描述方法的目的。大多数州的方法是否是用于识别和量化的一个活性成分或杂质,提取和衍生化步骤是否就业准备样品,以及是否正常使用阶段或反相色谱法。
这是紧随其后的是一个项目说的确切功能所需的工具,方法和类型的列(pre-column,如果需要的话)。由于高效液相色谱设备和列类型显著不同,这一项是非常重要的;它可能决定使用某些品牌的高效液相色谱法,特定探测器,或特定属性有关管道和注入循环的大小。也有部分州操作参数以及准备所需的化学物质流动相(s),参考(标准)解决方案和测试样品的解决方案。在许多方法,您可能会发现一段陈述一些特殊指令和规则对各种解决方案的准备和注射的序列。
你喜欢作为一个PDF阅读这?
一旦你确定必要的设备,列,和化学品,下一步是开始建立你的仪器进行测试。是非常重要的检查高效液相色谱仪器的校准状态。所选仪表必须通过所有的校准测试成功;这通常表示由贴纸或标签仪器说最后的结果和日期和下一个校准。进行校准测试以确保仪器的每一部分工作在一个合适的范围内。例如,泵的流量必须检查匹配数字输入;类似的测试进行了探测器,注射器和列加热器。目的是确保所有仪器在实验室正常工作,在一个预定义的误差。
选择你的乐器后,必须清洗和准备列。清洗步骤必须删除任何剩余的残留物从先前的工作;因此稳定的基线和准确的结果是可以实现的。许多国家特殊序列的方法洗涤系统测试之前。一般来说,清洗过程涉及自来水首先删除任何缓冲残留物,紧随其后的是纯甲醇或异丙醇/甲醇混合。最后,通过系统50%的有机溶液冲洗。最后冲洗的构成解决方案很大程度上取决于色谱使用的类型:逆转或正常阶段。列也刷新基于其类型,和流动相的组成。参考列的传单来确定最佳冲洗和列存储解决方案。
第一个解决方案准备通常是流动相(年代)。有时你需要准备一个以上的流动相梯度系统时使用你的分析方法。非常关键的使用高效液相色谱级水和溶剂准备移动阶段。
一旦你已经准备好你的流动相,是时候开始冲洗系统和相应的解决方案,并开始平衡你的专栏。大多数的高效液相色谱系统在本质上是第四纪的,即可以从四个不同的入口管道泵。如果使用超过一行(即方法涉及一个梯度),那么最终的解决方案是通过每一行应该是溶剂冲洗,与流动相兼容。
例如,如果移动阶段有很高的缓冲区的内容,然后进线一定是冲水冲洗至少50%解决方案以防止移动阶段盐沉淀,堵塞入口线。所有冲洗解决方案和移动阶段应该透过微过滤器(0.45µm或0.2µm)去除细菌和有机碎片。
后刷新您的系统并开始均衡列——在某些情况下可能需要3个小时或更多的取决于列类型和流动相的组成——你应该开始你的样品和参考解决方案。在许多情况下,您需要采取特殊的预防措施在准备这些解决方案,如低光照和水分,防止被分析物(s)从退化和产生错误的结果。这些特殊的预防措施通常提到的分析方法。参考和示例解决方案也应该透过特殊的过滤器被称为注射器过滤器(因为他们是安装在一个注射器)。然而,使用过滤器的类型和材料应符合分析物(s)和溶剂,以避免吸附或污染。
现在,是时候通过预设仪器运行您的解决方案。现代仪器运行通过软件,帮助您创建操作方法和序列的注射。它允许您确定解决方案的顺序被注入,大小和数量的注射。注射的顺序通常是在高效液相色谱分析方法或标准操作程序。序列通常始于注入一个空白(溶剂),那么一个或多个解决方案演示高效液相色谱系统的适应性包括列和流动相(年代)。几个参数的“系统适用性”解决方案(s),如分辨率或板计数,帮助您决定是否列,流动相及液相色谱仪器表现统称为所需的方法。还建议将测试系统通过执行复制注射的再现性的参考解决方案(5、6)。再现性是表示通过计算面积的相对标准偏差为感兴趣的主峰。
在这个阶段你可能会面临一些问题需要修正系统。故障排除的技能是非常重要的对于任何分析化学家一般;这需要时间和耐心来获得这些技能。这里是一些最常见的故障排除的摘要高效液相色谱分析师所面临的事件:
这相当大的跳把技术分析方法的宝座。你可以很容易地找到高效液相色谱设备实验室的所有形状和品牌分析制药、环境和食品样品,由于高效液相色谱法分析复杂混合物的非凡能力,而不需要大量的样品制备步骤。
值得注意的是,液相色谱一词包括一些技术,如薄层色谱法,制备,纸色谱法。本指南重点是高效液相色谱法(HPLC),因为它是最常用的常规测试的技术。如果你了解仪器的原理和性质,但发现测试过程稍微混乱,本指南可以帮助你找到自己的方向在一个快节奏的实验室,利用高效液相色谱经常。
为液相色谱测试做准备
分析高效液相色谱方法对初学者来说是无法避免的。这些方法通常挤满了相关信息和指示的每一步实验。熟悉高效液相色谱方法的格式在实验室里是很重要的,所以你可以很容易地找到你的过程。
大多数书面程序首先介绍或范围描述方法的目的。大多数州的方法是否是用于识别和量化的一个活性成分或杂质,提取和衍生化步骤是否就业准备样品,以及是否正常使用阶段或反相色谱法。
这是紧随其后的是一个项目说的确切功能所需的工具,方法和类型的列(pre-column,如果需要的话)。由于高效液相色谱设备和列类型显著不同,这一项是非常重要的;它可能决定使用某些品牌的高效液相色谱法,特定探测器,或特定属性有关管道和注入循环的大小。也有部分州操作参数以及准备所需的化学物质流动相(s),参考(标准)解决方案和测试样品的解决方案。在许多方法,您可能会发现一段陈述一些特殊指令和规则对各种解决方案的准备和注射的序列。
你喜欢作为一个PDF阅读这?
在这里下载
选择你的高效液相色谱仪器和设置
一旦你确定必要的设备,列,和化学品,下一步是开始建立你的仪器进行测试。是非常重要的检查高效液相色谱仪器的校准状态。所选仪表必须通过所有的校准测试成功;这通常表示由贴纸或标签仪器说最后的结果和日期和下一个校准。进行校准测试以确保仪器的每一部分工作在一个合适的范围内。例如,泵的流量必须检查匹配数字输入;类似的测试进行了探测器,注射器和列加热器。目的是确保所有仪器在实验室正常工作,在一个预定义的误差。
选择你的乐器后,必须清洗和准备列。清洗步骤必须删除任何剩余的残留物从先前的工作;因此稳定的基线和准确的结果是可以实现的。许多国家特殊序列的方法洗涤系统测试之前。一般来说,清洗过程涉及自来水首先删除任何缓冲残留物,紧随其后的是纯甲醇或异丙醇/甲醇混合。最后,通过系统50%的有机溶液冲洗。最后冲洗的构成解决方案很大程度上取决于色谱使用的类型:逆转或正常阶段。列也刷新基于其类型,和流动相的组成。参考列的传单来确定最佳冲洗和列存储解决方案。
制备高效液相色谱测试中使用的解决方案
第一个解决方案准备通常是流动相(年代)。有时你需要准备一个以上的流动相梯度系统时使用你的分析方法。非常关键的使用高效液相色谱级水和溶剂准备移动阶段。
一旦你已经准备好你的流动相,是时候开始冲洗系统和相应的解决方案,并开始平衡你的专栏。大多数的高效液相色谱系统在本质上是第四纪的,即可以从四个不同的入口管道泵。如果使用超过一行(即方法涉及一个梯度),那么最终的解决方案是通过每一行应该是溶剂冲洗,与流动相兼容。
例如,如果移动阶段有很高的缓冲区的内容,然后进线一定是冲水冲洗至少50%解决方案以防止移动阶段盐沉淀,堵塞入口线。所有冲洗解决方案和移动阶段应该透过微过滤器(0.45µm或0.2µm)去除细菌和有机碎片。
后刷新您的系统并开始均衡列——在某些情况下可能需要3个小时或更多的取决于列类型和流动相的组成——你应该开始你的样品和参考解决方案。在许多情况下,您需要采取特殊的预防措施在准备这些解决方案,如低光照和水分,防止被分析物(s)从退化和产生错误的结果。这些特殊的预防措施通常提到的分析方法。参考和示例解决方案也应该透过特殊的过滤器被称为注射器过滤器(因为他们是安装在一个注射器)。然而,使用过滤器的类型和材料应符合分析物(s)和溶剂,以避免吸附或污染。
运行系统适用性的解决方案和解决您的系统
现在,是时候通过预设仪器运行您的解决方案。现代仪器运行通过软件,帮助您创建操作方法和序列的注射。它允许您确定解决方案的顺序被注入,大小和数量的注射。注射的顺序通常是在高效液相色谱分析方法或标准操作程序。序列通常始于注入一个空白(溶剂),那么一个或多个解决方案演示高效液相色谱系统的适应性包括列和流动相(年代)。几个参数的“系统适用性”解决方案(s),如分辨率或板计数,帮助您决定是否列,流动相及液相色谱仪器表现统称为所需的方法。还建议将测试系统通过执行复制注射的再现性的参考解决方案(5、6)。再现性是表示通过计算面积的相对标准偏差为感兴趣的主峰。
在这个阶段你可能会面临一些问题需要修正系统。故障排除的技能是非常重要的对于任何分析化学家一般;这需要时间和耐心来获得这些技能。这里是一些最常见的故障排除的摘要高效液相色谱分析师所面临的事件:
- 低压、高压和不稳定的压力:背压是一个重要的指示如何操作优化您的系统。低压是泄漏的迹象在你的一个连接,而高压是堵塞的标志(可能发生由于溶剂如前所述)不兼容或恶化的列。不稳定的压力主要是由系统中气泡的存在。特殊冲洗程序可能需要移除泡沫和恢复稳定的条件。在一些系统中,不稳定的压力可能是一个内部零件磨损的迹象,如止回阀或清除熔块。
- 注射复制再现性差:这是证明了高相对标准偏差。首先应该检查注射器;肮脏的注射器将不会提供一致的结果。在其他情况下,气泡的存在在瓶的解决方案可能会造成;一些方法建议用瓶之前注射消除气泡。
- 一对关键的山峰之间失去了解决你想检测:保持密切位于山峰之间的分辨率对高效液相色谱法测试的成功至关重要,因为它允许对准确测定不同的组件。分辨率下降可能是由于日益恶化的列或在某些情况下,特别是在梯度方法——故障在梯度比例阀(世)的仪器。
处理你的色谱图,计算并提交结果
一旦你确定你的系统正常工作,简历的顺序注射注入样品的解决方案。完成序列之后,您可以使用特定的软件处理获得的色谱图,这样可以得出有意义的结果。一些软件程序允许你“集成”所有的山峰,不管他们有多小。每个峰面积计算,生成用于确定数量的结果测试。
有两种主要类型的计算后高效液相色谱实验:首先,确定一个或多个活性成分的内容通过使用一个化验,如计算扑热息痛在平板电脑市场的内容。或者,您可能希望确定色谱配置文件,即确定杂质的类型和它们的相对比例。当前的软件可以进行计算和产生一个最终报告,输入分子重量和稀释后的因素。
最后,提交所有文件和结果检查和批准。每个实验室拥有自己的程序这个过程。
引用
1。高效液相色谱系统的进化。(无日期)。从http://www.labmanager.com/lab-product/2010/06/evolution-of-hplc-systems .Wz22NvkzbIV检索
广告
