7个技巧来提高你的免疫印迹

蛋白质是细胞的分子机制,确保每一个细胞在体内可以执行其特定的作用。科学家经常希望研究蛋白质和实现这一目标的一个方法是通过免疫印迹。这是一个技术利用抗体识别感兴趣的蛋白质混合在一个生物样品。首先,通过凝胶电泳分离样品的分子量。然后转移到固体膜蛋白质,硝基或PVDF,紧随其后的是一个阻塞步骤防止流感的抗体绑定膜。感兴趣的蛋白质是探索使用特定的抗体,最后被二次抗体,经常共轭荧光团。膜可以扫描可视化感兴趣的蛋白质。

前几个月我的博士我尝试了很多西方的污点(之前我只有读到的东西,我的意思是,能有多难找一个单身带清洁污点?)。这绝对不是像我预期的那么简单,我和每一个污点得到不同的结果和我的屁股总是在后台的斑点。

这促使我做很多故障诊断沿路一个完美的西方,在这里我将提供一些建议关于如何实现这一目标。

干净的一切

这不能强调足够严重。任何污垢,灰尘或剩余的凝胶板上或膜将显示为背景的屁股上。,因为生活是不公平的,我的背景似乎总与我的乐队应该因此干扰任何后续的量化。防止背景的方法之一是清洗所有的盘子和梳子与SDS 1%或70%乙醇其次是蒸馏水然后擦干。此外,确保你总是戴手套和所有其他设备如钳是干净的,太。

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做你最好的凝胶

有时候,工作时间将会被放入之前准备样本进行免疫印迹;但如果凝胶没有准备好你所有的努力可能会浪费了,这将是一个巨大的耻辱!

跟随你的食谱

确保你的解决方案是正确的和在合适的pH值;堆积胶通常是酸性pH值6.8和凝胶分离碱性pH值8.8。

丙烯酰胺的比例

你使用的丙烯酰胺的比例成正比是多么容易蛋白质在凝胶中移动。如果您感兴趣的蛋白质低分子量和丙烯酰胺的比例太低,你冒这个险的凝胶。在开始准备凝胶之前,检查你的蛋白质的分子量和决定哪些凝胶百分数是最合适的。

给聚合凝胶足够的时间

通常我准备稍微叠加凝胶,凝胶分离,所以我可以检查的管我准备解决方案,看看他们是否有聚合而不是操纵凝胶本身。我发现做新鲜的10% APS改善凝胶的聚合,它不会花很长时间准备。如果一个凝胶没有适当的聚合这可能导致“波浪”乐队。最好是在这个阶段要有耐心!

不要让这种凝胶干燥

浇注后分离胶(确保你留下足够的空间叠加凝胶和梳子)填补空白的水合异丙醇同时聚合。这将确保你实现平线的顶部分离胶和它不会变干!分离凝胶聚合后,您可以把您的覆盖解决方案,与ddH2O洗净,在继续之前将你的叠加凝胶。你准备了凝胶后,一定要用它后不久,尽量避免让它在室温下脱颖而出。如果你有事先准备好的凝胶,有很多方法来存储这些供以后使用。你可以将它们与SDS运行缓冲纸浸泡或倒一些ddH2O的凝胶和密封拉链袋,凝胶可以保持在4°C好几天。应该在边缘,这种凝胶开始减少最好就重新开始!

Red-to-Red, Black-to-Black

我必须重复这个至少每次我100倍进行免疫印迹!如果电极插入错误的积极/消极出口电场将逆转,和你的样品会流错了路的凝胶。这是一个很容易犯的错误,但几乎没有时间仔细检查。

转移你的蛋白质凝胶膜

蛋白质“跑到红”或“阳极运行”

一个简单的方法记住在转学三明治就是“跑到红”这个词。如果你认为蛋白质会流动的凝胶膜的选择,你的凝胶需要带负电的黑色一侧(阴极)和你的膜带正电的红色一侧(阳极),这是当前流动一样。

妥善处理你的膜!

总是戴手套,确保你的钳是干净的,任何泡沫的转移三明治。就像我之前说的,灰尘和污垢就会出现在你的污点!气泡会阻止蛋白质从凝胶迁移到膜,为了避免这种情况您可以使用一个小滚轮或边缘的一个塑料50毫升管排出任何泡沫转学三明治。

别让太热转移

坦克转移可以产生大量的热,导致问题转移。要克服这一点,确保传输缓冲区都是事先准备好,并有足够的时间冷却(它总是可以前一天准备)。通常,记录在案会冰袋,可以插入到坦克,这将有助于降低温度。确保你的冰块都是和冷冻前转移你的凝胶。此外,您可以在冰上进行转让或在一个寒冷的房间里。降低电压和减少传输时间还可以减少传输过程中产生的热量。你可以尝试不同时期/电压和找出最适合你和你的蛋白质!

检查如果你转移工作

之前阻塞和immunodetection步骤,验证是很有用的,如果你的蛋白质已经成功地从凝胶转移到膜。这可以快速、轻松地通过一种蛋白质Ponceau-S等污渍。通过这种方法你也将能告诉转移期间如果有任何问题,如一个不均匀的转移或气泡被困在转让三明治。你可以把这个时间标记的取向膜用铅笔,特别有用如果你没有明显的阶梯!

阻塞和洗

现在,这些可能是最重要的步骤在最小化的背景膜。

阻塞是一个关键的一步增加特异性的抗体通过阻断非特定的抗体结合位点。阻止我的膜,我用5% BSA在TBS-T。小费我采用了过滤这个解决方案在使用它之前,这个移除任何可能显示为背景的微粒。我通常块膜在室温下1小时。其他常用的阻断剂包括脱脂奶粉。

有必要洗膜与TBS-T每个抗体孵育后的步骤。我洗膜3乘以每5分钟与温和的风潮。这将删除任何游离抗体,因此减少背景!

抗体

必须测试一系列不同浓度的抗体和找出给你最好/最干净带在你的污点。抗体制造商经常提供这些信息数据表。太多的抗体,和您可能会看到过度背景污点,抗体太少,你可能不会看到任何东西。

确保你包括控制在测试你的抗体。例如,二次抗体产生乐队没有任何主要抗体礼物吗?如果是这样的话,它可能会导致假阳性结果。

一定要仔细检查这一物种的反应性抗体和是否符合你的样品。

检测

我使用IRDye共轭LI-COR抗体,可以探测到他们的奥德赛®成像系统。这些染料可以在700 nm或800海里发现渠道。

排除你的抗体浓度——如果你有太多的次要风险不具体的绑定你的膜,你猜怎么着,你会有很多背景!此外,太多的二级可能绑定到你的乐队感兴趣的和饱和的信号,然后你就不能够量化。我通常在每个强度手动扫描我的膜《奥德赛》®扫描仪,因此我可以告诉当信号高峰。

当检测蛋白质在700纳米和800纳米通道,确保你的中学是专门检测正确的蛋白质在正确的通道。高度交叉检测蛋白质的吸附辅助建议在这两个渠道,因为它们是不太可能互相交叉反应。