ELISA成功的8个重要提示

ELISA因其简单、特异性和成本效益而受到青睐，是全球许多实验室使用的有用技术。可用于多种分析物的酶联免疫吸附测定试剂盒可在商业上购买，尽管这些试剂盒往往昂贵且资金紧张，特别是在研究环境中。这导致许多实验室开发自己的分析方法，特别是在预算有限或需要分析许多样品的情况下。尽管该技术总体上易于使用，但仍有许多因素需要考虑，以便设计稳健和可靠的分析。这里有一些我在这条路上的经历，我想分享一下，希望能帮你节省时间、压力和金钱，并帮助你达到最好的效果!

1.明智地选择你的表面

由于酶联免疫吸附法中用于包衣的蛋白质的多样性，有各种各样的专业微孔板，它们具有各种结合特性和能力。当开发一种新的检测方法时，应评估一系列表面，以确定哪一种表面最适合待检测的抗体/抗原。大多数钢板都是由相同类型的塑料制成的，如聚氨酯或聚氯乙烯，但它们的结合性能不同。至少值得尝试几种具有低、中、高结合能力的塑料。在选择塑料时，成本也是一个重要的考虑因素，特别是在需要测试大量样品的情况下。此外，用于涂覆平板的分子应适当滴定，以确定在试验中使用的最佳浓度。

2.棋盘格

虽然在分析中使用高浓度抗体似乎是明智的，特别是当被检测的分子在样品中不是很丰富时，这可能是违反直觉的。适当滴定所有抗体用于分析，以及样品，确保信噪比是最佳的;目的是在尽可能低的背景下，尽可能高的光密度(OD)，以设计良好和敏感的分析。当使用过多的抗体时，由于非特异性结合，背景噪声会很高。当浓度过低时，分析将失去灵敏度。一种有效的测试方法是对用于涂层的分子、样品和二抗(加上任何其他抗体，例如设计夹心ELISA时)进行一系列的连续稀释，并对每种情况进行阴性对照。这样就可以在几个简单的实验中确定每种药物的最佳浓度。多种类型的塑料也可以同时分析。

3.适当的样品稀释是关键

在研究测定法到测定法的可变性时，经常忽略样品的适当稀释。当样品在使用前需要稀释时，例如使用血清时，逐步稀释对于最小化移液误差至关重要。例如，如果棋盘实验确定血清在加入培养皿之前应稀释1:10，则明智的做法是对样品进行1:10稀释，然后再进行1:10稀释。虽然这似乎是显而易见的，但这通常不会被执行，并且会在实验之间产生巨大的差异，这对研究人员来说是令人沮丧的，并且可以非常简单地避免，从而提高分析的可靠性。当在同一实验中比较样品时，不适当的稀释也会产生误导性的结果。例如，如果正在比较两个血清样本以确定是否发生了血清转化，由于稀释技术不佳，如果添加了过多的转化前样本，则稀释不当的样本可能意味着错过了血清转化。

4.并非所有的抗体都是一样的

虽然这可能并不总是可能的，当有不止一种针对目标蛋白质的抗体可用时，最好对每一种都进行测试。在选择抗体时需要考虑很多因素。多克隆抗体具有更广泛的靶标范围，并且通常更便宜，但可能降低检测的特异性。单克隆抗体通常更昂贵，但如果抗体使用的表位在目标抗原上可见(但如果不可见，则可能根本不结合)，则更具特异性。通常唯一的测试方法是尝试来自不同制造商的一系列抗体。值得庆幸的是，许多制造商为此目的提供小样本，或者如果被要求，他们愿意提供这些。当选择用于夹心elisa的抗体对时，这种选择变得更加重要，因为抗体必须彼此识别不同的表位。

5.小心阻挡意外

许多研究人员在试验的发展阶段试验了一系列阻断剂，并选择使用具有最佳信噪比的阻断剂。在做出这种选择时经常考虑的一个因素是特定阻滞剂的批次变化。阻滞剂通常是生物制剂，如牛血清白蛋白(BSA)。在广泛的检测中，牛血清白蛋白是一种非常有效的阻断剂，但由于试剂的性质，它在批次之间的差异很大，有些批次含有大量的交叉反应性抗体，这将干扰实验，而有些批次含有很少甚至没有。因此，如果选择阻滞剂，如牛血清蛋白或胎牛血清，谨慎的做法是测试几个批次，以检查结果的一致性，然后再承诺一个给定的。这是一个重要的考虑因素，对于不幸的人来说，一旦最初测试的批次被用完，往往会导致许多实验失败!如果看到批次之间的差异，但阻塞剂的选择无法修改，通常制造商很乐意保留特定批次，如果他们被咨询并知道将使用多少。

6.二抗的批量检测

与阻断剂类似，二抗的批次也可能不同。虽然他们的整体活动可能不会改变，但所需的量可能因批次而异。当购买另一批二抗时，值得用前一批做一个简单的实验，以确保使用的浓度仍然合适。假设可以使用相同的稀释度，有时意味着当批次改变时，背景噪音突然变得高得多，这可能是一个令人讨厌的惊喜!

7.别忘了正常化!

通常被忽视的是，标准化处理板/实验之间的任何差异，并尽量减少其对整体结果的影响。在使用血清作为分析物的实验之间，一种简单的归一化方法是将每个血清样本的结果与阴性血清对照的结果进行比较。通过这样做，任何来自外部因素(如室温和开发时间)的变化都被最小化。用被试样品的外径除以对照样品的外径，结果可以表示为倍数变化。虽然这不是绝对的量化，通常绝对数字是不必要的，但仍然可以获得一组可靠的结果，并且可以相互比较样本。

8.了解动态范围

当设计一个用标准曲线来确定样品浓度的实验时，重要的是要保持在你用来读板的仪器的动态范围内。这些值将在制造商手册中指定;许多机器的上限是~1.5 OD。在制作标准曲线时，最高标准品(即浓度最高的标准品)的外径必须低于动态范围的最高值。通过使用高于此范围的标准，根据标准曲线推断结果变得有风险，因为任何高于此数字的外径都可能不准确。许多新型号的平板阅读器能够调整动态范围，但如果您使用的模型不可能调整动态范围，则需要在标准曲线设计中考虑最大外径。为了准确测量和确定浓度，所有样品也必须落在这个动态范围内，因此也必须考虑样品稀释。这在一开始可能会令人沮丧，但一旦操作者对一批样品的浓度范围有了感觉，很可能可以使用符合该范围的标准稀释样品，并为将来的实验提供良好的结果。