成功使用CRISPR-Cas9的9大秘诀

CRISPR-Cas9是一种革命性的基因组和表观基因组编辑资源，它迅速取代了旧的基因组编辑工具。因为这是一项新技术，许多科学家和研究人员都不太了解它的复杂之处。并且，想要提高他们对这个在实验室中引起轰动的新工具的认识。如果你属于这一类，或者只是想学习一些技巧和技巧来优化基于crispr的实验，那么本指南就是为你准备的。

细胞根本不喜欢双链断裂

很简单，CRISPR-Cas9 DNA编辑产生DNA双链断裂(DSB)，由与其基因组目标互补的RNA分子引导。然而，dsb具有极强的细胞毒性，如果不进行修复，可能导致细胞死亡。细胞修复DSB一般有两种方式:通过非同源末端连接(NHEJ)或通过同源定向修复(HDR)。^1、2当DSB的两个断裂末端被拴在一起时，NHEJ就会发生，通常会导致两条DNA链上的随机插入或缺失(indels)。因此，很难预测NHEJ修复的确切顺序。相反，HDR是一种不那么随机的修复机制，其中另一条染色体上与DSB同源的区域被用作修复模板。得到的序列将是另一条染色体的精确序列。在细胞中，这两种机制都用于确保基因组的完整性，但CRISPR-Cas9使用这些方法来生成感兴趣的基因编辑。¹

Cas9编辑的RNA组分

Cas9需要两种RNA组分才能正常工作:一种是位于3 '端的结构组分(tracrRNA)，另一种是将Cas9切割到位于5 '端的基因组靶标(crRNA)。这些可以组合形成嵌合的单导RNA (sgRNA)。^{1 2 3}本节将重点介绍crRNA或sgRNA中指导Cas9切割的部分的设计。

一般来说，至少有20个crRNA核苷酸必须与目标DNA链互补，在目标链的3 '端(也是crRNA的3 '端)有一个专门的NGG原间隔器邻近基序(PAM)序列。crRNA应该与目标序列互补。然而，互补crRNA和靶DNA之间存在一定程度的耐受性。^2、3事实上，crRNA可以与3或4个碱基错配的目标位点结合，特别是在远离PAM的序列中。重要的是，NGG不属于20个核苷酸同源性的一部分。靶区GC含量应达到50%，GC含量过高或过低都会破坏crRNA的靶向一旦gRNA与目标序列结合，在PAM的第3和第4个核苷酸之间产生DSB(即在20个碱基的目标序列的5′到3′方向上的第17和18个碱基之间)。^2、3从这里开始，CRISPR-Cas9切割事件发生，细胞将尝试使用NHEJ或HDR修复途径修复DSB。

基因敲除和缺失

基因敲除可以说是使用CRISPR-Cas9最容易编辑的基因。只需生成gRNA，添加Cas9，然后切割!然而，在描述基因敲除时，要确保所得到的indel不是3的倍数，因为这被认为是“帧内”缺失或插入，基因可能仍然正常工作。

由于CRISPR-Cas9编辑的健壮性，可以很容易地产生删除。Cas9只能结合一种gRNA，但不同的Cas9分子可以结合不同的gRNA并靶向不同的序列。正因为如此，在CRISPR-Cas9实验中很容易形成缺失。只需从所需的缺失中生成上游和下游的grna，并将其包括在实验中。基因反转和染色体重新定位也可能使用这种策略。

产生单核苷酸多态性

为了生成这些类型的编辑，我们利用细胞固有的HDR机制。该过程涉及Cas9蛋白与gRNA和供体DNA模板。当产生SNP或条件等位基因时，单链DNA寡核苷酸就足以作为DNA模板供体。为了指导正确的DNA修复，DNA寡核苷酸中应该包含50-80bp的同源臂。²标准ssDNA合成的典型最大长度为200bp，然而，如果需要更大的敲入，有些公司可以生成高达1.5kb的ssDNA。理想情况下，切割位点(在PAM的第三和第四个碱基之间)是所需SNP的位置，但如果不是，切割位点应该距离要编辑的碱基不超过10bp。在供体DNA模板中，包含一定程度的变异以防止Cas9切割先前编辑的DNA是非常重要的，因为只要gRNA能够识别互补DNA, Cas9就会继续产生双链断裂。^2、3因此，重要的是尝试并定位所需的SNP尽可能靠近PAM，以1)破坏PAM周围的碱基以防止gRNA退火并使Cas9切割，2)最大化所需编辑的同源臂。

大型建筑敲入

对于较大的编辑，如基因插入或在特定位点插入磁带，质粒DNA可以用作供体模板。在这种情况下，同源臂的长度应至少为800bp，最长可达2kb。线性双链DNA(如PCR片段)也可以用作修复模板，但您应该记住，在某些生物体中，线性片段可以随机整合到基因组中。使用CRISPR-Cas9编辑的大敲入效率极低。在这些情况下，具有较大的样本量可能是有用的，因为只有一两个细胞可能最终具有所需的敲入。此外，必须去除敲入结构中潜在的Cas9切割位点，因为只要目标序列存在，gRNA-Cas9复合体就会继续产生dsb。对于较大的敲入盒，包括抗生素耐药性标记、荧光标记或一些其他基因标记来识别可能已将该结构整合到其基因组中的细胞可能是有用的。

CRISPR编辑可以一次产生多个编辑

所有CRISPR-Cas9事件的潜在机制是，它在RNA分子的引导下在一个位点切割DNA，然后使用天然细胞机制产生感兴趣的编辑。在一个CRISPR实验中，有可能在一个基因中产生一系列有用的编辑。例如，在一个细胞或胚胎中，有可能通过NHEJ修复Cas9 DSB，产生可能导致基因敲除的indel。而在另一个细胞中，DSB可以通过HDR修复，使用DNA供体作为修复模板，在感兴趣的基因上产生SNP。在某些情况下，双等位基因编辑可以产生，两条染色体得到相同的敲入或基因破坏，尽管这种情况很少见。

在开始之前有基因分型策略吗

信不信由你，产生crispr编辑事件非常容易。另一方面，找出最终的基因型可能需要更多的劳动。以下是一些标准基因分型方法的快速概述:

1. PCR检测:这种方法依赖于从样本的基因组DNA中扩增基因片段，并且可以很容易地用于检测缺失或插入。
2. 桑格测序:为了确定确切的序列，可以对PCR片段进行测序或将其克隆到质粒中，然后进行测序。Sanger对原始PCR产物进行测序的缺点是，一旦测序迹线到达切割位点，就无法获得太多数据，因为有可能从两条染色体产生不同的读数。为了确定确切的序列，需要克隆，这是非常劳动密集型的，如果筛选许多样品，可能不合适，因为每个菌落只能克隆一条染色体的一个遗传片段。
3. Illumina下一代测序:这种方法类似于Sanger测序，但提供了更高的通量，因为每个PCR片段可以产生数千个单独的reads，而人工最少。这也消除了克隆的需要，因为每个单独的读取随后被合并，为每个提交的样本提供一个大的数据集。这种方法的一个问题是，只有短片段，小于400bp，可以可靠地测序，如果你只表征少数样品，它可能不是一种经济有效的方法。
4. PCR产物的限制性文摘:一旦indel被表征，或者如果HDR在SNP中包含一个唯一的限制位点，就可以使用这种方法。简单地扩增纯化的基因组DNA片段并加入限制性内切酶。确保检查PCR缓冲液中限制性内切酶的活性，以避免PCR纯化步骤。
5. 表型选择:这可以是抗生素耐药性标记，荧光蛋白的产生，或将非天然基因引入细胞。这些是检测你感兴趣的基因引入的最简单的方法，但迄今为止效率最低。这种类型的选择只能在引入大敲入或基因盒时使用。

非目标效应

CRISPR并不是一个完美的基因组编辑工具。如前所述，crRNA与基因组靶序列的结合可能存在变化，允许crRNA退火到脱靶序列并产生DSB。然而，在减轻CRISPR-Cas9编辑事件可能产生的脱靶效应方面已经取得了进展。首先，基因组测序文库和在线工具可以帮助设计grna，减少你试图编辑的任何基因组中的脱靶位点。我经常使用的gRNA设计工具是CRISPOR服务器(http://crispor)。Tefor.net/)评估目标活动以及潜在的非目标站点。另外，CCTop服务器(https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/is)用于确定目标站点，而CasOFFinder服务器(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)擅长发现潜在的非目标站点。大多数模式生物的基因组都有完整的测序，因此gRNA的发育可以很容易地简化，以找到潜在的脱靶位点。随着脱靶效应分析越来越主流，我们对选择哪些grna的理解也越来越清晰。

另一种减少脱靶效应的方法是修改Cas9蛋白，使其减少切割。目前已开发的Cas9主要有两种变体，其中蛋白质的DNA结合能力大大降低这里的逻辑是，如果Cas9蛋白不能与DNA物理结合，脱靶编辑就会减少，这是真的。这些修饰的cas9的好处是，crRNA不再与目标序列有任何不匹配。DNA结合减少的Cas9变体可以购买到，名称为Cas9- hf1、eCas9和Alt-R Cas9。

Cas9的最后一种变体减少了脱靶效应，这种变体只会破坏DNA，而不会产生DSB。²切割DNA可以防止NHEJ的发生，并产生可以使用HDR修复的断裂。这为在缺口位点提供供体DNA模板以将感兴趣的编辑整合到基因组中提供了机会。切割Cas9的脱靶效应几乎完全被减轻，因为不会产生dsb，任何脱靶位点将通过修复刻痕而最小化。然而，基因敲除在有缺口的cas9中非常罕见，通过HDR进行修复也减少了，因为细胞修复DNA中的缺口比为HDR投入能量要容易得多。

现代CRISPR适应

许多研究小组正在利用催化死亡形式的Cas9 (dCas9)来产生表观遗传编辑。^1、4CRISPR-Cas9的原理保持不变:使用gRNA靶向基因组上的特定区域的Cas9，唯一的变体是Cas9的活性残基(天冬氨酸和组氨酸)被丙氨酸取代，使其催化活性降低。当转录激活因子或抑制因子与dCas9融合时，研究小组使用dCas9来调节基因表达。⁴dCas9也被用于组蛋白修饰或DNA甲基化方面的表观遗传修饰。⁴胞苷脱氨酶也可以与dCas9融合产生位点特异性碱基取代而不产生DSB。绿色荧光蛋白可以与dCas9融合，以跟踪和成像染色体上的特定位点。最后，Cas9的同源蛋白如Cpf1 (Cas12a)也可以在基因组DNA中产生dsb，除了产生交错末端。Cpf1还识别不同的PAM序列NTTT，这扩展了基因组中的编辑能力。⁵此外，Cas13可以编辑RNA而不是DNA，这可能对进一步的治疗开发有益，因为没有对DNA进行编辑。⁶

参考文献

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