如何选择合适的免疫印迹检测方法
西方墨点法是一种分子生物学技术基于以大小的蛋白质的分离和检测。它由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)其次是蛋白质的转移到膜(硝基或聚乙二烯二氟化物- PVDF)以及随后与中小学抗体检测的蛋白质。可以找到详细的免疫印迹协议在这里。
重要的是要理解的优点和缺点不同的方法检测感兴趣的蛋白质在膜上。在这里,我们提出三个主要类型的蛋白质免疫印迹检测:1)放射性,2)酶,3)荧光如图1所示。
1。放射性检测
的第一个主要抗体检测的方法是使用二次开发抗体标记放射性同位素(PMID: 388439)。碘- 125是一个受欢迎的选择相对较长的半衰期和发射的伽马射线组成的低能量光子能被探测到的容易使用x光片。一旦受欢迎的技术,它的使用现在比较少见。
优势:放射性检测提供了良好的敏感性和可量化的。
缺点:
•很费劲的二级抗体通常必须用放射性同位素标记的最终用户。
•相当昂贵。
•危险,需要具体的辐射安全培训,适当的个人防护装备(PPE),注册表和废物处理系统。
•有限保质期的检测抗体由于放射性衰变的标签。
建议:不要使用,更多的现代方法更有效——见下文。
2。酶的检测
最常见的一种方法,在免疫印迹检测是基于使用二次抗体与酶共轭。二次抗体提供了绑定特异性主要抗体识别的靶蛋白,而连接酶用于检测。孵化后与二次抗体膜的,解决方案包含特定底物应用于膜。底物的酶催化转化,这是严格本地化网站二级抗体绑定到的膜。反应导致形成一种不溶性的沉淀膜或释放的光子,可以检测和量化。这是比色和化学发光检测的基础上,分别。
一个。比色
两种最常用的酶在比色检测碱性磷酸酶(美联社)和辣根过氧化物酶(合)。孵化后二次抗体的免疫印迹膜共轭AP或合,膜与解决方案包含一个孵化酶的底物。在美联社的情况下,底物四唑盐,减少不溶性甲瓒。合的显色底物包括diaminobenzidine (DAB) tetramethylbenzidine(三甲)和azino-ethylbenzothiazoline-sulfonic酸盐(abt)。显色免疫印迹膜上的酶促反应的产品是可见的眼睛和大多稳定在很长一段时间。沉淀的量可以量化和对应分析蛋白质的数量。
优势:
•便宜的和快速的。
•生成的有色产品是稳定的(几个小时到几天),从而使成像和量化甚至几周后印迹。
缺点:
•难以量化的用户定义的时间沉淀反应,这在大多数情况下是不可逆转的。测定的线性范围有限。
•灵敏度,通常需要至少毫微克的分析蛋白质的存在创造可见的乐队,不如化学发光和荧光检测方法。
建议:使用抗体筛查和快速评估。
b。化学发光
合和美联社酶也可以用于化学发光检测与适当的基板。合相比是更常用的美联社由于广泛的底物和敏感性的增加通过使用鲁米诺-或acridan-based化合物。类似于比色检测、免疫印迹膜与二次孵化抗体与酶结合,然后应用解决方案包含适当的衬底上薄膜。反应的中间产品生产低能量能被探测到的光子通过将膜对数字x射线胶片或聚集的电荷耦合器件(CCD)相机。与比色检测,产品不是不溶性和不可见的形式沉淀膜。内的反应是短暂的,需要检测前几分钟到几小时。商用合基板提供了更大的敏感性。
优势:
•分析蛋白质的敏感性,毫微微克可以检测和量化使用特定的合基板。
•量化——数码相机的使用允许识别过度曝光膜,以确保测量检测的线性范围内。
缺点:
•定时检测发射光,只在一个底物转化为产品-检测需要添加底物后立即执行。
•缺乏多路复用——如果两个研究蛋白质的大小相似,同时检测的蛋白质与化学发光检测是不可能的。连续检测是必需的——第一个检测抗体需要剥膜孵化前的第二个靶蛋白抗体。膜剥离需要额外的时间和适当的控制,以确保没有从膜蛋白质损失。
建议:适合量化和高灵敏度需要由于低水平的蛋白质样品分析。
3所示。荧光检测
在这种方法中,检测抗体不与酶结合,但荧光团。荧光团兴奋一个特定能量的光,从而导致更长的波长的光线发射(例如;680 nm的激发和发射694海里)。免疫印迹膜与二次孵化后抗体是成像设备配备雪崩光电二极管(adp)或CCD摄像机检测到辐射光。与酶的检测,不需要使基板检测。使用荧光体通常是年底极右翼的光谱(红色和红外)以减少自发荧光。检测需要使用专用设备的照明与光膜选择光谱。的光源主要是led或激光。滤波器组允许的具体检测荧光团和减少背景。使用不止一个荧光团与重叠发射光谱允许同时多个检测抗体的检测不需要洗,re-probe膜。
优势:
•多路复用——允许同时检测两种蛋白质的分子量非常类似,当检测抗体对共轭具有不同的荧光团。这是特别有用,当比较磷酸化蛋白质占总蛋白质的丰度水平。
•膜稳定性,孵化后检测抗体,可以存放数月在室温和信号检测在方便的时候。
•简单易用,不需要任何额外的步骤在孵化前膜与二次抗体检测。
缺点:
•需要专用设备检测和图像采集。需要使用特殊的PVDF膜由于自然自发荧光标准的PVDF膜。
•敏感性——低于化学发光检测,但线性范围宽。
建议:理想的量化和多路复用。
所有的检测方法提出了提供优势但也有局限性。重要的是要优化免疫印迹协议和实验条件以达到最好的结果。伟大的结果需要一个好的信噪比,通常可以很容易通过最小化的背景或改善弱/没有信号,非特异性。
