药物发现中的靶标反褶积方法

基于观察到的表型反应的药物靶点的回顾性鉴定被称为靶点反褶积。目标反褶积可以通过多种方法实现，包括;亲和层析、表达克隆、蛋白芯片、“反向转染”细胞芯片和生化抑制。

这个列表强调了五种可以应用于目标反褶积的方法。

1.亲和色谱法

亲和层析法通过修饰小分子(配体)来实现目标反褶积，引入一个“连接剂”使其能够被固定化，然后将固定化配体与蛋白质提取物一起孵育。通过清洗去除未结合的蛋白质，只留下与配体有足够强亲和力的结合蛋白。然后使用干扰目标蛋白-配体相互作用的缓冲条件洗脱结合蛋白。然后识别目标蛋白-通常使用质谱或免疫检测方法。

2.Expression-cloning

噬菌体显示、mRNA显示和三杂交系统都是表达克隆技术的例子。

噬菌体展示

噬菌体展示使您能够以噬菌体库的形式在噬菌体表面呈现潜在的靶蛋白。噬菌体(显示不同的蛋白质)然后暴露于小分子候选药物(固定化)。与小分子有亲和力的噬菌体被“捕获”，并通过清洗去除未结合的噬菌体。结合噬菌体显示的目标蛋白，被洗脱和扩增使用细菌宿主细胞。然后使用DNA测序来识别蛋白质目标。

信使rna显示

mRNA显示是一个在体外方法，其中cDNA文库被扩增和转录，所得到的mrna被连接到DNA连接子和在体外进行翻译以生成蛋白质- mrna融合分子。这些基因被纯化，并反向转录以生成cDNA模板(用于以后的扩增)。mRNA显示分子文库与固定化的候选药物一起孵育，通过洗涤去除未结合的蛋白质-核酸复合物。然后，cDNA被扩增(PCR)以产生一个富含结合药物的蛋白质的文库。后续选择后，用DNA测序鉴定cDNA。

三辆混合动力系统

三混合系统通过三个部分的相互作用发挥作用。第一个由连接配体结合域的dna结合域组成。第二种由连接到小分子候选药物的配体组成。第三个成分是由融合到蛋白质(一种潜在的药物靶点)的转录激活域组成。如果小的候选药物与蛋白质结合，三个部分连接形成三聚体复合体，导致报告基因的表达-用于测量相互作用。

3.蛋白质微阵列

蛋白质微阵列能够高通量分析靶标和候选药物之间的分子相互作用。要分析的蛋白质目标首先被纯化，随后被固定在玻片上。生成的数组具有许多潜在目标(固定在特定位置)。它与小分子候选药物的标记版本一起孵育。然后彻底清洗该阵列以去除任何未结合的分子。洗涤后，任何剩余的标记信号“点”都表明药物-蛋白质结合成功。然后，标记的药物-蛋白质复合物的位置可以映射到固定在该位置的特定蛋白质靶标。

4.反向转染细胞芯片

“反向转染”细胞微阵列有时被称为“活”微阵列，因为使用的是活细胞(用cdna转染)而不是蛋白质。转染的细胞在阵列的不同位置表达特定的cdna，因此阵列被在特定位置过表达特定蛋白质的细胞簇所覆盖。与蛋白质微阵列一样，细胞微阵列与小分子候选药物的标记版本一起孵育，从而能够检测目标蛋白质。

5.生化抑制

生化抑制是识别药物靶点和信号通路组分的一种替代策略。与许多其他目标反褶积策略不同，这种方法不依赖于分子对其生物目标的亲和力。生化抑制包括向蛋白质提取物中添加一个小分子，它可以抑制感兴趣的活性——抑制作用是用活性测定法来测量的。首先，将蛋白质提取物与已知抑制感兴趣活性的分子混合。然后将未受抑制的蛋白质提取物分馏并引入到受抑制的提取物中，然后可以确定是否有任何馏分抑制抑制。如果鉴定出抑制小分子抑制活性的分数，则进行进一步的分馏以纯化抑制活性。

参考文献

Terstappen, G.， Schlüpen, C.， Raggiaschi, R.， & Gaviraghi, G.(2007)。药物发现中的目标反褶积策略。自然评论药物发现，6(11)，891-903。doi: 10.1038 / nrd2410
Wermuth, C.， Aldous, D.， Raboisson, P.， & Rognan, D.(2015)。药物化学实践(第4版，第45-70页)。