介绍了光学显微镜、光学显微镜技术和应用程序
自然界中一些最基本的过程发生在微观层面,远远超出了我们的极限通过眼睛可以看到,这促使技术的发展让我们看到超出这个极限。早在4th世纪,人们发现了一种光学镜头的基本概念,和13所示th世纪,他们已经使用玻璃镜片改善视力和放大物体,如植物和昆虫,以更好地理解他们。1随着时间的推移,这些简单的放大镜发展成先进的光学系统,称为光学显微镜,它让我们看到和了解微观世界的极限之外的感觉。今天,光学显微镜是一种核心技术在许多领域的科学和技术,包括生命科学、生物学、材料科学、纳米技术、工业检测、取证和许多更多。在本文中,我们将首先探讨光学显微镜的基本工作原理。在此基础上,我们将讨论一些更高级形式的光学显微镜常用的今天和比较他们的优缺点为不同的应用程序。
光学显微镜是什么?
显微镜和光学显微镜是如何工作的
简单和复合显微镜
类型的光学显微镜
- - - - - -亮视场显微镜
——暗视野显微镜
——相衬显微镜
——微分干涉对比显微镜
——偏振光显微镜
——荧光显微镜
——免疫荧光显微镜
——共焦显微镜
——双光子显微镜
——光片显微镜
——全内反射荧光显微镜
——扩张显微镜
光学显微镜是什么?
光学显微镜是用来让小结构和样品通过提供他们如何与可见光的放大图像,例如,他们的吸收、反射和散射。这是有用的了解样品的样子和它是什么做的,但也让我们看到过程的微观世界,比如物质分散在一个细胞膜。
显微镜和光学显微镜是如何工作的
基本上,显微镜包括两个子系统:一个照明系统来照射样品和生产放大图像的成像系统的光与样品相互作用,然后可以被眼睛或使用相机系统。
早期的显微镜使用照明系统包括阳光收集并反映到样本的一面镜子。今天,大多数显微镜使用人造光源,如灯泡、发光二极管(led)或激光更可靠的照明和控制系统,可以根据一个给定的应用程序。在这些系统中,光从源通常是使用聚光透镜收集然后形状的光过滤被聚焦到样品之前。塑造光实现高分辨率和对比度是至关重要的,通常包括控制样本区域照明,光线的角度影响着它。照明光的光学滤波,使用修改其频谱和偏振光学过滤器,可以用来突出样本的某些特性,提高薄弱的能见度签名或观察样品的荧光。
图1:基本复合显微镜:光从源聚焦到样品使用镜子,聚光透镜(对象)。光从样品收集的客观,形成一个中间图像成像再次的目镜和传递,将样品的放大图像。
成像系统收集照明光与样品和生产放大图像,可以查看(图1),这是通过使用两个主要的光元素:
- 首先,一个物镜收集尽可能多的光从样例
- 第二,一个目镜继电器的收集光观察者的眼睛或摄像系统。
成像系统可能还包括元素,如光阑和过滤器,从样本选择光的某些部分,例如只看到样品,光被散射或某种颜色的光的波长。在照明系统的情况下,这种类型的过滤可以非常有用的单一感兴趣的某些特性,仍将隐藏当样品成像的光。
总的来说,照明和成像系统光学显微镜扮演着一个关键角色,如何执行。从光学显微镜得到最好的在你的应用程序中,必须有一个好的理解的一个基本的光学显微镜是如何工作的,和今天有什么变化。
简单和复合显微镜
图3:左:简单的显微镜。来源:水W。/奥克兰博物馆。复制下创作共用署名4.0国际4.0 (CC)许可证。右:复合显微镜。信贷:雅克从开普敦,南非。复制下Creative Commons归因2.0通用许可证。剪裁突出一个乐器。
复合显微镜,样品从底部观察透射光照明,或从顶部观察反射光。光从收集的样本是一个光学系统组成的两个主要透镜组:个人权力的客观和目镜,繁殖,使更高的放大比通过一个简单的显微镜。目的收集样本,通常有一个放大的光40 - 100 x。一些复合显微镜功能多个客观镜头转台称为“喷嘴”,允许用户选择不同的放大。图像从目镜的目标是拿起,再放大图像和继电器用户的眼球,与典型的目镜的放大10倍。因此,复合显微镜总放大,这是客观的产品放大和目镜放大,通常位于400 - 1000 x的范围。
例如,使用绿光的波长550 nm和客观的典型NA 0.7,一个标准的光学显微镜可以解决特性到极限为0.61×(550海里)/ 0.7≈480海里,足以观察细胞(通常10µm大小),但并不足以观察细节的小生物,如病毒(通常是250 - 400 nm)。图像较小的特性,更高级的和昂贵的目标更高的NA和更短的波长可以被使用,但这可能不是适合所有的应用程序。
在标准复合显微镜(图4),样本(通常是在载玻片)舞台上举行,可以手动或电子更高的精度,和照明系统在显微镜的下部,在成像系统在样本。然而,显微镜的身体也通常可以是适应特定的用途。例如,立体显微镜(图4 b)特性两个目镜在一个轻微的角度,允许用户看到一个三维图像。在许多生物学应用程序,一个倒置显微镜的设计(图4),在照明系统和成像光学低于样品阶段促进放置如细胞培养到它的容器。最后,比较显微镜(图4 d)经常被用于取证,例如比较指纹或子弹眼出现之前的数码显微镜,使得图像被保存和比较。
图4 :复合显微镜的身体。一)标准的直立的显微镜说明(1)eyepiece(接目镜),(2)客观的炮塔,左轮手枪,或旋转喷嘴(持有多个客观镜头),(3)客观镜头聚焦旋钮(移动阶段)(4)粗调整,微调(5),(6)阶段(保存标本),(7)光源(光或镜子),(8)隔膜和冷凝器、机械阶段(9)。信贷:GcG(污斑)。 b)立体显微镜。 信贷:GcG(污斑)。 倒置显微镜。 信贷:Kitmondo实验室。转载 的知识共享归因2.0通用许可证。d)比较显微镜。 信贷:Tamasflex。复制下 的知识共享Attribution-Share都3.0Unported许可证。
类型的光学显微镜
亮视场显微镜
暗视野显微镜
暗视野显微镜技术,只有光分散的样本收集。这是通过增加光阑,阻止照明光直接成像,这样只有照明光分散的样本。这样,暗视野显微镜突出小结构散射光(图6),并且可以非常有用的揭示BFM中不可见的特性,而无需以任何方式修改样品。然而,作为唯一的光出现在最终的图像是分散,暗场图像可能非常黑暗和需要高照明权力,这可能会破坏样品。
图6:亮场和暗场成像。)聚合物微观结构在明亮的照明领域。b)暗场图像的结构一样),突出散射从边缘和表面污染。c)类似结构)和b),由100 - 300纳米的纳米晶体直径。只有光分散的纳米晶体是观察,而背景光强烈抑制。来源:作者。
相衬显微术
相衬显微镜(PCM)是一种可视化的技术变化引起的光学相位变化的样本光学路径长度。这使得成像透明的样品在BFM创建很少或没有对比,如细胞(图7),例如。因为光学相移不容易观察到的眼睛,相差显微镜检查需要额外的光学组件引起的相移样本转化为可见的最终图像的亮度变化。这需要操作的照明系统和成像系统利用光阑和过滤器。这些形状和选择性相移的光从样本,其中包含了感兴趣的相位信息,照明光,这样他们在眼睛或检测器相长干涉,来创建一个可见的图像。
图7:相衬显微术的人类胚胎干细胞的殖民地。信贷林塞布丽娜,普鲁托尔伯特,干细胞中心加州大学河滨分校。
微分干涉对比显微镜
微分干涉对比显微镜(DICM)支持可视化的透明的样品,如生活,清白的细胞转换光学相位由于样本的光学路径长度变化干扰明显的对比,同样的PCM。然而,PCM相比,DICM可以获得更高分辨率的图像清晰度和形象文物介绍PCM减少所需的光学。DICM,照明光束是由一个线性极化偏振器和偏振旋转,这样它分为两个偏振光束垂直极化和一个小(通常是低于1µm)3他们之间的分离。遍历样本后,梁都是重组,他们相互干扰。这创建了一个图像对比成正比区别在两个偏振光束之间的光学阶段,因此得名“微分”干涉显微镜。图片由DICM出现相关三维方向抽样梁之间的位移,从而导致样品的边缘有明亮或黑暗区域根据光之间的相位差的符号两个(图8)。
图8:微分干涉对比显微镜。左:DICM示意图设置。右:成人生活秀丽隐杆线虫(秀丽隐杆线虫)由DICM线虫成像。信贷:鲍勃•戈尔茨坦细胞图像库。复制下3.0 Unported Creative Commons归因3.0许可(CC)。
偏振光显微镜
在偏振光显微镜,样本与偏振光照明光的检测也对偏振敏感。为了达到这个目标,偏振器是用来控制照明光偏振和限制偏振成像系统检测到的只有一个特定的极化。通常,照明和探测偏振设置垂直,这样多余的背景照明光线不与样品强烈抑制。这个配置需要一个 双折射样本 介绍旋转照明光的偏振角,这样它可以检测到的成像系统,例如观察晶体的双折射和厚度和折射率的变化(图9)。
图9:偏光显微镜。橄榄石的显微图累积岩,形成的晶体双折射不同的积累。样品厚度和折射率的变化导致不同的颜色。来源:r·希尔CSIRO。
荧光显微镜
荧光显微镜用于图像样本,发出荧光,也就是说,它们发出长波长光波长较短的光照射的时候。例子包括生物样品内在荧光或用荧光标记标签,以及单分子和其他纳米荧光团。技术采用短波长光照明的光学过滤的组合让——样品荧光,这样最终的图像只显示样品的荧光部分(图10)。这允许挑出和可视化荧光分布的粒子或感兴趣的细胞被染色的染料从样本中许多其他荧光粒子组成。同时,荧光显微镜也可以克服传统光学显微镜的分辨率限制通过标记颗粒小于这个极限。例如病毒可以标记荧光标记来显示他们的位置4或荧光蛋白,如绿色荧光蛋白,5可能表达的生物样本。这项技术也被用于检测塑料微粒。结合各种小说形式的照明样本,利用荧光显微镜使”超分辨率“显微技术6打破传统的光学显微镜的分辨率极限。荧光显微镜的主要局限性之一是光漂白,标记或粒子停止发出荧光,因为照明光的吸收过程最终改变其结构,使得他们不再发光。
免疫荧光显微镜
我mmunofluorescence显微镜是一种特定变化的荧光显微镜,主要用于微生物学可视化生物分子计算单元内的位置。这里,抗体与荧光标记或标记本质上荧光绑定到感兴趣的生物分子,暴露了他们的位置。7
共焦显微镜
共焦显微镜是一个图像散射或荧光显微镜技术从一个样本。照明和成像整个样本,一个照明点来自点状光源扫描样本地区,只有从这一点与敏感的探测器探测到,产生一个2 d图像。这种方法允许在高分辨率成像和样品弱信号因为超出了不必要的背景信号采样点是有效地抑制。这里使用的波长和客观限制的大小在所有三维成像的位置。这允许2 d图像在不同深度内的样本通过移动目标不同距离样本。这些2 d图像“切片”可以联合创建的3 d图像样本,这是不可能与其他讨论宽场显微镜技术和还允许测量样品的尺寸在3 d。这些优势为代价的不能拿一个图像一箭,而是要建立图像逐点,可耗费时间和抑制实时成像的一个示例(图12)。
图 12 :单分子荧光共焦荧光图像。从单个分子小点对应的荧光,而较大的点对应于集群的分子。这里的荧光背景比在一个简单的弱荧光显微镜图像,所看到的亮点之间的黑暗区域。来源:作者。
双光子显微镜
双光子显微镜(TPM)是一个变动的荧光显微镜,利用双光子吸收激发荧光,而不是单光子激发。这里,荧光吸收两个光子的组合很兴奋的大约一半所需的能量由一个单光子激发。例如,一个荧光团由单一的蓝色光子通常兴奋可以由两个近红外光子兴奋在这个计划。TPM的形象是建立逐点就像在共焦显微镜,也就是说,双光子激发点扫描整个样品和样品荧光检测到一个敏感的探测器。大不同励磁和荧光能量会导致多个优势相比传统的荧光显微法:首先,它允许使用长激发波长的散射少样本内,从而更深入地渗透允许成像的样本低于其表面和创建3 d图像。同时,光漂白的激发能大大减少低得多,这对脆弱的样本是非常有用的。背景荧光的激发点也大大减少,因为有效的双光子吸收只出现在激发光束的焦点,这样可以观察到荧光从一小部分样品(图13)。
TPM的一个缺点是双光子吸收的概率远低于单光子吸收,因此需要高强度照明等脉冲激光器实现实际的荧光信号强度。
光片显微镜
光片显微镜是一种荧光显微镜的样品被一层薄薄的光垂直于方向的“表”的观察,这样只有一个薄片(通常几微米)样品的成像。8 通过序列图像样本时旋转的光片,就可以形成三维图像。这需要样品主要是透明的,这就是为什么这种技术常被用来形成小的3 d图像,透明的生物结构,如细胞、胚胎、生物等斑马鱼 9(图14)。
全内反射荧光显微镜
全内反射荧光(TIRF)是一种荧光显微镜技术,将二维荧光图像的一种极薄的(约100纳米厚)样本切片。10这是通过激动人心的样品的荧光照明光的损耗字段,这发生在当它发生全内反射的两种材料之间的边界不同折射率(n)损耗字段具有相同的波长的光照明,但紧密地绑定到接口。在TIRF显微镜,激发光通常发生全内反射在载玻片之间的接口(n = 1.52)和水介质(n = 1.35)样品分散。隐失场的强度下降指数与界面的距离,这样只有荧光团关闭接口中观察到最终的图像。这也会导致强烈的抑制荧光的背景区域外片,可以捡起微弱的荧光信号,例如当本地化单分子。这使得TIRF非常有用的微弱信号的观察荧光蛋白(图15)参与细胞间的相互作用,但还需要样品分散在水介质,这可能限制类型的样品可以测量。
图15:TIRF图像显示培养的视网膜色素上皮细胞蛋白质荧光。每个像素对应于67海里。信贷:艾伦·刘,桑德拉·l·施密德细胞图像库。
扩张显微镜
显微镜扩张背后的基本概念是增加样本的大小,通常需要高分辨率显微镜,这样它可以与标准的显微镜成像技术,特别是荧光显微镜。这种模式非常适合保存标本如生物分子、细胞、细菌和组织切片,可以扩大同样在所有维度(各向同性的)50 x使用化学过程11如图16所示。扩大样本允许孤立的个人感兴趣的特征,通常是隐藏的,可以让他们透明让他们内部成像。
图16:为扩张显微镜样品制备。细胞染色然后与聚合物凝胶矩阵。然后溶解细胞结构本身(消化),允许与凝胶染色部分扩大各向同性的,允许彩色结构成像和更多细节。
反褶积在光学显微镜
除了适应光学系统到一个特定的用例,现代光学显微镜也利用数字图像处理,如图像反褶积。12这种技术可以让空间分辨率的增加以及定位精度补偿与光学显微镜拍摄的图像的光学系统本身固有的模糊。这个模糊可以测量校准步骤,然后可以用来deconvolve图像,从而减少模糊。通过结合高性能光学与先进的图像处理,数字显微镜13可以推动的极限分辨率进一步进入微观世界。
图17:图像反褶积。左:原始荧光图像。右:图像反褶积后,显示增加细节。来源:作者。
光学显微镜和电子显微镜之间有什么区别?
光学显微镜通常使用在可见光谱波长的光,它固有的限制空间分辨率由于瑞利判据大约一半波长使用最多(约200海里)。然而,即使在使用目标高NA和先进的图像处理,这个基本的限制不能被克服。相反,观察小结构需要使用较短的波长的电磁辐射。这是基本原则电子显微镜用于照明,电子样本而不是可见光。电子有一个关联的波长比可见光短得多,它允许放大10000000 x实现,这样,即使单个原子可以解决。14
图18:扫描电子显微镜图像15000 x放大同心聚合物纳米晶体的结构。甚至细节如衬底的毛孔都解决了。来源:作者。
摘要和结论
光学显微镜是一种强大的工具用于检查小样品在一个大范围的应用。通过调整照明和成像技术用于特定的用例,可以获得高分辨率图像,提供洞察微观结构和过程的样本。在本文中,我们已经讨论了功能,各种光学显微镜技术的优点和缺点,不同光影响和收集。
光学显微镜技术比较表
技术 |
优势 |
限制 |
典型的应用 |
亮视场显微镜 |
相对简单的设置和一些光元素 |
低对比度,完全透明对象不能直接成像和可能需要染色 |
|
暗视野显微镜 |
揭示了结构和表面粗糙度小,允许成像清白的样本 |
高照明功率需要破坏样品,只能散射图像特征 |
|
相衬显微术 |
支持透明的样品的成像 |
复杂光学设置,高照明电力需要破坏样品,一般较暗的图像 |
|
微分干涉对比显微镜 |
更高的分辨率比PCM |
复杂光学设置,高照明电力需要破坏样品,一般较暗的图像 |
|
偏振光显微镜 |
从non-birefringent地区强大的背景抑制的样本,允许测量样品的厚度和双折射 |
需要一个双折射样本 |
|
荧光显微镜 |
允许个人荧光团和特定领域的样品中挑出,可以克服分辨率极限 |
需要一个荧光样品和一个敏感的探测器,光漂白可以减少信号 |
细胞成像组件、单分子蛋白质25 |
免疫荧光显微镜 |
可视化使用抗体针对特定的生物分子 |
广泛的样品制备,需要样品荧光、光漂白 |
|
共焦显微镜 |
低本底信号,可以创建3 d图像 |
成像速度慢,需要一个复杂的光学系统 |
3 d细胞成像,成像样品荧光信号较弱,表面分析28。 |
双光子显微镜 |
深样品渗透率、低背景信号,更少的光漂白 |
成像速度慢,需要一个复杂的光学系统和大功率照明 |
|
光片显微镜 |
图片只有一个极薄的样本,可以创建3 d图像旋转的样本 |
成像速度慢,需要一个复杂的光学系统 |
3 d成像的细胞和生物体8 |
全内反射荧光显微镜 |
强大的背景抑制,极细垂直切片 |
成像样品薄区域有限,需要一个复杂的光学系统,样品需要在水介质 |
|
扩张显微镜 |
增加有效的标准分辨率荧光显微镜 |
需要样品的化学处理,不适合生活的样本 |
高分辨率成像的生物样本11 |
B
引用
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