质谱在生物制药分析中的应用

生物制药的复杂性和异质性使其生产、筛选和开发具有挑战性。关键质量属性(cqa)，如翻译后修饰(PTMs)——例如天冬氨酸异构化为异天冬氨酸——会影响产品质量，必须在整个药物发现和开发过程中进行识别和表征。分析技术，例如质谱法确保生物制剂的安全性和有效性。MS的敏感性和特异性使其成为一种不可或缺的工具生物制药分析，包括生物制品的表征和高阶结构(HOS)分析。软电离技术的引入和仪器的众多进步导致了定量、质量控制、生物相似性评估和许多其他生物制剂分析方法的发展。¹

“MS提供了在制造、加工或在处理或存储期间进行化学修饰时产生的关键PTMs(包括聚糖)的生物分子的准确质量，”他说阿努拉格·拉索尔博士他是印度理工学院化学工程系的教授。在谈到MS的效用时，Rathore博士分享了他实验室的一个研究案例。单克隆抗体(mAbs)(常用于癌症治疗的治疗方法)的电荷异质性被归类为CQA。他说:“在一项研究中，我们已经证明了一种方法，在这种方法中，单克隆抗体的电荷异质性被原生MS识别。”²

杰瑞德·奥克莱尔博士马塞诸塞州波士顿东北大学生物技术和信息学主任、生物制药分析培训实验室主任，他赞同Rathore的想法:“使用MS进行生物制药分析的最主要优势之一是能够识别产品的主要氨基酸结构，以及存在的特定PTMs和这些PTMs的位置(例如，糖基化、脱酰胺化和氧化)，”他说。

“MS提供的灵敏度和特异性也是一个关键优势，”Auclair补充道。“多属性方法(MAM)等新方法允许序列、PTMs和新峰值检测(NPD)被发现。NPD可以洞察生物制药的变化，以及存在的杂质。我们在实验室中使用MS来观察宿主细胞蛋白谱，并试图改进MAM过程。”

无处不在的质谱在生物制药分析中的应用

不同类型的MS，如QTOF，三重四极子(TQ)， MALDI已被用于生物制药分析在药物发现、开发、ADME研究、定量、杂质分析、生物分析甚至临床分析期间。下面列出了基于ms的技术在生物疗法生命周期各个阶段的分析应用的一些例子:

药物发现和开发

质谱是一种用于研究治疗性蛋白(如抗体)的结构、质量、疗效和稳定性的敏感技术发现阶段。通过研究细菌或病毒蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用，它也是了解潜在疾病机制和确定假定药物靶点的有效工具。针对新确定的靶标测试现有药物或重新使用的药物也可以加快治疗的开发时间并降低成本。^3.另一个应用MS进行药物发现的例子是使用MALDI-TOF / TOF MS以确定异天冬氨酸残基在多肽标准中的确切位置，作为一种治疗性单抗，已知其重链中含有异天冬氨酸残基。⁴它是众所周知，天冬氨酸异构化生成异天冬氨酸是药物研发过程中需要监测和控制的关键质量属性(CQA)。

ADME研究

质谱可用于了解吸收、分布、代谢和排泄(ADME)的候选药物。应用解吸电喷雾电离(DESI) -质谱成像(MSI)和MALDI-MSI研究了免疫抑制剂环孢素(CsA) -环非肽及其代谢产物在小鼠全身切片和大鼠器官中的空间分布和代谢。MSI是一种无标签技术，可以同时检测母药及其代谢物，非常适合ADME研究。⁵

量化

四极飞行时间质谱联用于液相色谱仪用数量来表示22-KDa生长激素是一种重组人类生长激素，75年降至10 ppb水平μL鼠血浆。反褶积法测定的血药浓度与生长激素四种最强烈电荷状态(14+至17+)的反应总和具有良好的相关性。⁶

基于串联质量标签(TMT)的方法和靶向质谱法已经实现了对强制降解样品、可比性样品和单抗三硫化物标准品中单抗的多位点特异性PTMs定量。⁷

质量分析

QTOF质谱的高分辨率和高质量精度已被用于开发MAM，以研究其安全性、有效性和安全性单克隆抗体质量．与进行多个正交试验相比，使用单一的工作流程来监测糖基化谱、蛋氨酸氧化、色氨酸氧化、天冬酰胺脱酰胺、n端焦磷酸和糖基化更省时、成本更低。⁸

的应用毛细管电泳(CE)连字符为MS单克隆抗体和融合蛋白的完整质量分析，以及在单剂量药代动力学小鼠研究中两个Fc-FGF21分子的生物转化研究，已被描述。⁹

杂质分析

基于质谱的方法用于确定生物制药的质量，通过测定PTMs，定量宿主细胞蛋白杂质保证糖基化的一致性等。¹⁰通过对四种不同生物制药产品、两种不同工艺变体和一种模拟发酵的HCP的鉴定和定量，采用散弹质谱分析和酶联免疫吸附法(ELISA)对其上下游工艺参数进行了评价。¹¹

结构关系

作为糖基化治疗性蛋白的安全性和有效性的影响，有必要对糖蛋白进行表征。高分辨率原生质谱不仅可以揭示复杂糖聚糖的独特特征，而且有助于确定糖蛋白结构与其细胞功能之间的相关性。¹²

生物分析法

采用三重四极杆串联质谱联用超高压液相色谱(UHPLC)进行定量分析帕西肽，一种用于治疗库欣病和肢端肥大症的环六肽。将该方法应用于生物分析法测定血浆中帕西肽含量，定量下限(LLOQ)为5 pg/mL。¹³

临床分析

MS的应用实例临床分析将是配体结合试验(LBA)与三种多重LC-MS/MS的混合，已开发并验证用于分析人血浆中的总抗体和抗体-药物偶联物MEDI4276。该方法已应用于首次人体临床试验。¹⁴

使用MS的优点和局限性

灵敏度十亿分之一或更低，特异性高，分辨率高的某些质谱仪，动态范围广，可用于多种格式，以及将其与不同的分离技术相结合的能力，使MS成为生物制药分析的通用工具。质谱硬件和技术的发展，如氢/氘交换(HDX)-质谱和蛋白质的快速光化学氧化(FPOP)，已被用于表征生物治疗的高阶结构，包括表位定位、聚集评估和可比性研究。¹⁵

然而，基于ms的生物制药分析可能由于各种因素而具有挑战性，包括大量的样品制备、有限的通量和对熟练操作人员的需求。¹⁶

“当在变性条件下对生物分子进行分析时，由于弱非共价相互作用的破坏，导致蛋白质原生结构信息的丢失，这是一个主要问题，”Rathore描述道。“虽然已经引入了原生MS，但在使用MS兼容的缓冲液时仍然存在挑战，因为这些缓冲液中生物分子的电离性差。”

在Auclair看来，使用ms生物制药分析的瓶颈与它的复杂性有关。“最大的挑战是仪器的复杂性和潜在的数据分析。此外，成本也可能成为MS使用的障碍。”

未来的机会

在评论对生物制药分析产生最大影响的技术发展时，Rathore博士说:“离子迁移质谱(离子迁移质谱)和质量分析仪已经取得了重大进展，可以使用天然质谱(MS)来分析聚糖异构体和复杂蛋白质的结构。”他还描述了MAM方法，这种方法允许在一次分析中分析生物疗法的各种CQAs，这是使用MS进行生物制药分析领域最有前途的发展。Auclair表达了类似的观点:“我认为MAM对生物制药分析产生了重大影响，允许同时监测多个cqa。我还认为新的仪器越来越容易使用，也越来越不复杂，”他说。

有人建议，基于ms的方法可以支持以设计求品质(QbD)实施，因为它除了提高分析效率之外，还提供了更好的产品和过程理解。¹⁷当被问及如何发展时例如自动化、人工智能(AI)的使用和QbD支持MS在生物制药分析中的应用，Rathore说:“这些发展将导致分析中的成本、时间和错误的降低，并提高可重复性和稳健性。它们还将有助于实时监测cqa中的重大偏差。”Auclair解释说，QbD是任何药物开发项目的关键工具:“在一个过程的开始建立质量实践将有助于最终实现产品的商业化(例如，更快，更便宜，但仍然安全，有效和高质量)。MS允许在QbD过程中分析多个cqa。”

具有人工智能功能的新型生物信息工具也可以支持基于ms的生物制药分析的数据处理的未来进展。Auclair说:“生物信息学工具，本质上是那些具有AI/ML功能的工具，可以实现实时数据分析，并实现工艺变更，以确保生产出最优质的产品。”

至于基于ms的生物制药分析中尚未满足的需求，Auclair总结道:“我认为在自动化、灵活性和集成方面还存在额外的需求。在过程分析技术(PAT)领域有一个重要的机会，可以提供实时数据分析和过程变更的实现。最后，我认为生物制药分析将随着更复杂的产品进入市场(例如，细胞和基因疗法)而发展。”

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