寡核苷酸的技术分析

寡核苷酸,包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),越来越多的被用于诊断和治疗。例如,DNA引入免疫细胞基因工程师他们表达嵌合抗原受体蛋白细胞免疫疗法。¹他们也被用作DNA折纸模拟设计分子疫苗的病毒颗粒。²各种各样的RNA,包括信使核糖核酸(mRNA)和小干扰RNA (siRNA),也被用于瞬态表达式和干扰蛋白质的蛋白质的表达式分别为治疗应用。

需要高纯度的寡核苷酸

根据 Balasubrahmanyam Addepalli辛辛那提大学研究助理教授,尽管越来越使用的寡核苷酸,它仍然是具有挑战性的净化他们由于“失败序列和最终产品与完整的保护组织。”

寡核苷酸的合成使用固态合成技术可以引进微量的杂质合成周期的每一步。随着寡核苷酸的长度增加,纯产品的产量减少。对寡核苷酸的修改,如附件的聚乙二醇来增强稳定性和生物利用度,还可以在合成过程中引入的杂质。

更常见的杂质:

• n - 1 shortmers由于反应失败
  
  
• n + 1 longmers由于单一耦合连续一步添加两个分子phosphoramidite和
  
  
• 磷酸二酯的残留量不完全硫化和副反应。

一个审查由Goodchild雄辩地总结了建立寡核苷酸合成技术自1970年代以来一直在自动化。³随着寡核苷酸的使用增加,变得日益重要的净化采用有效的方法,分析和描述。

净化的寡核苷酸

聚丙烯酰胺凝胶电泳 (页面)是一个标准的方法,可用于根据它们的大小不同的寡核苷酸。⁴聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺的聚合形成的第一个交联剂的存在,导致是因为凝胶网络。然后应用电场,使带负电荷的迁移寡核苷酸走向正极。根据寡核苷酸的大小,小分子通过凝胶网络比大企业更容易且快速。设定的时间后,大小不同的寡核苷酸在聚丙烯酰胺凝胶迁移的不同距离,允许他们根据大小提取和纯化。

然而,页面提供了低分辨率分离如果寡核苷酸在大小相似,一些修改甚至是分不开的。此外,页面分离是费力而耗时的。这些限制有动机从页面切换到液体 色谱(LC)方法 寡核苷酸净化。⁵

有各种各样的LC寡核苷酸的方法净化。例如,离子交换LC分离离子和带电分子寡核苷酸等基于离子交换剂的亲和力。然而,即二次折叠结构,三级折叠,二聚体和寡核苷酸聚合必须先变性与有机溶剂、高pH缓冲或高温(55 - 65^oC)。

最受欢迎的技术净化寡核苷酸 ion-paired反相高效(IP RP HP)信用证 。⁶在这种技术中,长的链状烷基胺添加在低浓度它与带负电荷的寡核苷酸在LC的流动相。寡核苷酸的保留和洗脱LC列等影响因素的寡核苷酸和离子对试剂烷基链的长度等triethylammonium醋酸。例如,保留时间普遍增加的比例寡核苷酸和长烷基链的疏水性的指控ion-paring试剂。通常,研究人员 优化参数 如列长度、流动相流速、分离温度和离子对试剂缓冲区组成寡核苷酸的分离和纯化。⁷IP RP高效液相色谱的一个关键优势是,它也可以直接耦合到质谱仪对寡核苷酸的详细质量特征。

质量特性的寡核苷酸

一个寡核苷酸的纯度分析的方法是使用质谱(MS)分析它们的质量。常见的方法之一 matrix-assisted激光解吸/电离时间飞行(MALDI TOF MS) 。⁸这种技术使用矩阵与化学激光电离寡核苷酸加速离子通过飞行之前样品管的探测器测量粒子计数作为时间的函数。TOF是直接与分子的质量成正比。MALDI TOF MS提供高吞吐量和理想的用于分析寡核苷酸低于50基地,随着电离效率和分离分辨率降低。还有一个风险,修改寡核苷酸光敏可能受损的强激光源。

女士要克服的局限性,科学家也结合技术。木村教授和他的同事们最近结合深度测序和女士描述转移核糖核酸RNA (t)。⁹”深度测序是一种高通量方法,读起来令人难以置信的数量的RNA序列在一个单一的运行。 然而,深度测序不能确定预测的化学性质的修改。相比之下,女士分析了寡核苷酸的组成和修改的位置。tRNA修改最严重的RNA分子,从历史上看,女士使用确定修改配置文件。 因此,在我们的论文,我们的利益都分析:以深度测序为预测修改网站和女士进行分析预测修改网站的详细描述,”木村说。

其他受欢迎的方法 electro-spray电离(ESI)女士 。这种技术适用于高电压从液体中产生气溶胶样品,目标分子电离成多个电荷状态由不同质谱可以deconvoluted为父峰值识别寡核苷酸和潜在的杂质。ESI MS是一个很好的工具来分析寡核苷酸大于50基地和使用电离条件温和,适用于感光的寡核苷酸。然而,吞吐量低于MALDI TOF ms .因此,取决于紧急特性和容忍错误,可以使用这两种方法。

寡核苷酸的结构表征

最强大的解决寡核苷酸的结构的方法是使用x射线晶体学已间接联系 许多诺贝尔奖 。¹⁰x射线波长相同的维度在分子原子间债券约1.5埃,可以提供详细的结构寡核苷酸。通过分析散射x射线、电子密度分布的样本可以确定重构内部分子排列。然而,重建并不容易,由于损失的相位信息必须使用傅里叶地图等计算方法解决。为了克服相位信息损失的问题,合成核苷和核苷酸类似物的方法 硒 已经开发出来。¹¹这些方法利用重原子, 硒 ,作为一个反常散射中心或引用,使相位的决心。

另一个主要问题在样品制备x射线晶体学是准备的结晶结构,需要非常小心,耗时。提高结晶的概率, 外消旋体 已经添加到增加分子的数量联系。¹²外消旋的晶体结构不同的DNA序列和折叠构象,包括工器和四重的甚至被证明是适合结构说明。RNA结晶学是特别具有挑战性由于缺乏表面化学多样性和灵活性差,不适合水晶包装。为了解决这个问题,谢尔曼和他的同事创造了工厂(fragments的一个ntib这里) 监护人协助RNA晶体学 促进晶体包装和决心使加速阶段。¹³

其他受欢迎的方法来描述结构的寡核苷酸 核磁共振(NMR) 。¹⁴核磁共振在x射线结晶学的优点是,分子没有结晶。当原子核在一个强大的恒定磁场被弱势振荡磁场摄动,就会发出电磁信号的频率特性在细胞核的磁场。这发生在共振频率时,振荡频率的外磁场与细胞核的固有频率相匹配。核磁共振光谱因此提供信息结构来源于特定的共振性质不同的原子核的样本。根据实验的具体目标,如分辨率,不同核磁共振结构。例如,二维核奥佛好塞效应光谱学(NOESY)核磁共振光谱可以解决样本结构5埃的一项决议。

未来的前景

寡核苷酸是一项重要的资源,为诊断和治疗,但为了让他们没有副作用,临床有用的合成和表征必须严格。使用页面或LC其次是女士是一个关键的一步分离和净化寡核苷酸。然而,寡核苷酸的结构中也扮演着重要的角色在他们的使用,如利用其构象模拟病毒颗粒。因此,x射线晶体学技术和核磁共振对阐明至关重要的寡核苷酸分子结构会帮助他们的结构关系,并推动使用分子设计的寡核苷酸提高更大的使用在生物医学设置。寡核苷酸的特征也主要集中在基因组DNA,但是 RNA的修改发挥重要的生理作用。以更大的调查,更多的RNA的修改和他们的角色也将阐明。

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