LC-MS/MS成功优化化合物的4步

在一个充满复杂性的现代世界里，我们暴露在数以百万计的新污染物中。这些未知化合物不仅对分析实验室陌生，而且对用于检测的仪器也陌生。化学仪器并不是神奇的，它需要引导参数来将目标化合物与仪器数据联系起来。因此，化学家需要确定和优化仪器进行分析的参数。

色谱-质谱联用是分析检测常用的仪器选择。特别是液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)常用于高灵敏度的痕量化学物质的识别和定量。¹

顾名思义，LC - MS/MS由液相色谱(LC)和质谱(MS/MS)组成。LC将目标化合物从样品中分离出来，而MS将其分解成片段进行鉴定和定量。

虽然许多化学家可能早就熟悉LC-MS/MS进行常规分析，但化合物优化的方法开发需要另一组考虑因素和操作。本指南为LC-MS/MS的化合物优化提供了一个简单的参考。

第一步:化学标准品的稀释

如果我们想教授一种未知化合物的仪器，我们需要一种不含其他化合物的化学标准。这是为了确保化合物优化不受我们用于优化的溶液中存在的其他化学物质的干扰。因此，通常采用纯化学标准进行优化。根据仪器灵敏度，用合适的溶剂将标准品稀释到合适的浓度(50ppb - 2ppm)。这种溶剂应该能够溶解化合物，同时不损坏仪器。首先，解决方案可以是用于分析的预期流动相的混合物。

步骤2:质谱优化

虽然含有化合物混合物的样品首先进入LC室，但化合物优化从MS/MS开始。我们从频谱中获得的信号大多是质谱操作的结果。为了确保我们最终得到的信号来自我们的目标化合物，而不是从LC中流出的其他东西，有必要首先得到我们的目标化合物的MS/MS参数。

质谱室通过电离和碰撞将化合物分解成碎片。化合物的身份是由检测到的碎片确定的。因此，化合物优化包括指定将化合物定向到探测器所需的能量和碎片所需的能量。

母离子电离能的优化

当化合物进入第一个MS隔室时，它通过电喷雾电离(ESI)或大气压化学电离(APCI)变成一个离子(称为母离子)。为了优化母离子的参数，我们需要知道它的质量。根据经验，质量通常是其分子量加上或减去原始分子的一个质子([M+H])⁺或(mh)^{- - - - - -})．找到母体离子质量的一些有用的资源是NIST化学网络手册 ²以及学术期刊文章。一旦母体离子的质量已知，就可以优化孔板电压。这是通过扫描一个电压范围来实现的，以选择最优的值，给予母体离子的最大响应。

在某些情况下，两者的反应都很低[M+H]⁺或(mh)^{- - - - - -}．可能的原因之一是离子在流动相或溶剂中与添加剂形成了加合物。例如，甲酸铵是一种常用的添加剂，可能导致加合物的形成。在这种情况下，可以尝试优化质量[M+NH4]⁺．

进入第一个MS隔室后，母离子到达碰撞室。通过与气体分子的碰撞，母体离子被分解成碎片。但是这些碎片是什么呢

碎片离子碰撞能量的优化

不同的碰撞能量形成不同的碎片，进而形成不同的光谱。通过扫描一系列的碰撞能量并叠加得到的光谱，人们可以识别出最丰富的碎片(或子离子)。每种化合物都有其特有的子离子分布。使用LC-MS/MS，可以选择多反应监测(MRM)同时监测来自一个父离子的多个子离子。

碰撞能量是MRM优化的关键参数之一。它是将母体离子分解成特定子离子所需要的能量。通过扫描产生每个子离子最大响应的碰撞能量，可以优化每个MRM对的碰撞能量。

通常的做法和标准是每个化合物至少有两个MRM对。第一对通常用于量化，而第二对用于确认。由于优化使用了标准，第一和第二离子对以特定的比例出现。这个比例也用于化合物的确认。

一种化合物只有在以下情况下才能被发现:

1. 与标准一样，它包含两个MRM对
2. MRM对与标准的比值相同

因此，建议为每种化合物优化至少两个MRM对。在某些情况下，子离子的质量可能与常用溶剂相同，或在样品制备中容易受到干扰。优化三个或四个MRM对(如果可能的话)以确保准确性总是有用的。

步骤3:色谱优化

在MS/MS隔间内进行优化后，下一步是优化LC条件。

LC分离依赖于由于色谱柱(固定相)和流动相(动态相)之间的竞争而使化合物的保留。色谱柱的选择取决于所研究化合物的物理和化学性质。例如，C18色谱柱通常用于非极性化合物。熟悉列规范总是有用的^3.或从色谱柱制造商处获得色谱柱选择指南。对于流动相，常用甲醇、乙腈和水或溶剂的混合物。添加酸或铵盐可用于提高峰分辨率和形状。

在选择合适的色谱柱和流动相后，还需要优化LC条件，包括流速、流动相梯度、色谱柱温度。这是为了确保化合物可以作为一个很好的分辨峰被识别和量化。如果LC条件不适合该化合物，则会产生畸变峰或尾砂。例如，虽然更快的流速可以提高运行效率，但流速过高可能会导致几个峰值合并在一起。因此，如果观察到一个变宽的峰，将流速减慢，并检查是否是由于两个峰重叠造成的峰是有用的。另一个技巧是修改流动相梯度。由于其中一种流动相的溶解度高，一些干扰化合物很容易被其中一种流动相洗脱。增加所使用的流动相的百分比可能有助于消除这些干扰，并为目标化合物产生良好的分辨率峰值。第三个技巧是使用均匀的柱温。虽然大多数LC运行可以在环境条件下使用，但固定色谱柱温度可以防止由于色谱柱内温度分布不均匀而导致的峰宽。⁴

第四步:用校准曲线验证

在样品制备之前，确定目标化合物的优化条件是正确的是很重要的。一种验证方法是使用不同浓度的溶液，或用校准曲线进行测试。如果得到的响应与化合物浓度成比例，并具有良好的分辨峰，则仪器方法应准备就绪。

参考文献

1. Tuzimski t;Sherma, J.(2015)高效液相色谱法在农药残留分析中的应用。CRC的新闻
2. NIST质谱数据中心。检索自2018年10月10日https://chemdata.nist.gov/。
3. 多兰，j.w.;莫尔,a;彬格莱,d;Wrisley l;陈振昌;Angod m;Lunte c;Krisko r;温斯顿，j.m.;霍默尔，文学学士; McCalley, D. V.; Snyder, L. R. (2004) Choosing an equivalent replacement column for a reversed-phase liquid chromatographic assay procedure. J. Chromatogr. A 1057, 59–74.
4. Dolan, j.w.(2014)温度的重要性。检索自http://files.pharmtech.com/alfresco_images/ pharma/2014/08/22/c91e07c2-9442-47b5-b2d1-c9d4f7e635db/article-23766.pdf于29-10-2018。