成功液相色谱的5个步骤
在过去的几十年里，色谱法已经有了很大的发展和进步。先进的设备已经发明出来，以提高色谱检测的效率，而且进展也扩展到获取和处理数据的软件。快速浏览一下这项技术的历史1显示了这一领域的发展;从由重力移动的大型填料柱和流动相开始，到由亚3微米珠子填充的50毫米柱，流动相使用强大的泵移动。
这一巨大的飞跃使该技术登上了分析方法的宝座。在分析药物、环境和食品样品的实验室中，您可以很容易地找到各种形状和品牌的HPLC设备，因为HPLC具有分析复杂混合物的卓越能力，而不需要广泛的样品制备步骤。
值得注意的是，术语液相色谱法包括几种技术，如薄层色谱法、制备色谱法和纸色谱法。本指南主要介绍高效液相色谱法(HPLC)，因为它是常规检测中最常用的技术。如果您了解仪器的原理和性质，但发现测试过程有点混乱，那么本指南可以帮助您在常规使用HPLC的快节奏实验室中找到方法。
分析型高效液相色谱法对初学者来说是难以应付的。这些方法通常都包含与实验每一步相关的信息和说明。熟悉实验室中HPLC方法的格式是很重要的，所以你可以很容易地找到你的方法。
大多数书面程序都以描述方法目的的介绍或范围开始。大多数说明该方法是否用于识别或定量活性成分或杂质，是否采用萃取或衍生化步骤制备样品，以及是否使用正相色谱或反相色谱。
后面是一项，说明该方法所需的仪器的确切特征和列的类型(如果需要，还有前列)。由于HPLC设备和色谱柱类型差异很大，这一项非常关键;它可能规定使用特定品牌的HPLC，特定检测器，或有关管道和注射环尺寸的特定属性。还有一节说明了操作参数以及制备流动相、参考(标准)溶液和测试样品溶液所需的化学物质。在许多方法中，你可能会发现另一节说明了一些关于各种溶液的制备和注射顺序的特殊说明和规则。
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一旦确定了必要的设备、色谱柱和化学品，下一步就是开始设置测试仪器。HPLC仪器的校准状态的检查是非常重要的。所选仪器必须成功通过所有校准测试;这通常通过在仪器上的贴纸或标签表示，说明上一次和下一次校准的结果和日期。进行校准测试，以确保仪器的每个部件都在适当的范围内工作。例如，必须检查泵的流量以匹配数字输入;对检测器、进样器和柱式加热器也进行了类似的试验。其目的是确保实验室中的所有仪器都在预定的误差范围内正常工作。
选择仪器后，必须清洗仪器并准备色谱柱。清洁步骤是很重要的，以清除任何残留的残留物从以前的工作;从而获得稳定的基线和准确的结果。许多方法都规定了在测试之前清洗系统的特殊顺序。一般来说，清洗程序包括先用自来水去除任何缓冲残留物，然后是纯甲醇或异丙醇/甲醇混合物。最后，50%的有机溶液冲过系统。最终冲洗溶液的组成很大程度上取决于所采用的色谱类型:反相或正相。该柱还根据其类型和要使用的流动相的组成进行冲洗。请参阅色谱柱的说明书，以确定适合色谱柱的最佳冲洗和储存方案。
首先要准备的解决方案通常是流动阶段。当使用梯度系统时，有时你需要为你的分析方法准备不止一个流动相。高效液相色谱级的水和溶剂是制备流动相的关键。
一旦准备好了移动相，就可以开始用相应的解决方案冲洗系统，并开始平衡色谱柱。大多数HPLC系统的性质是第四纪，即可以从四个不同的进口管道泵。如果要使用多条线(即方法涉及梯度)，那么通过每条线冲洗的最终溶液应该是与流动相兼容的溶剂。
例如，如果流动相具有高缓冲液含量，则必须用至少50%的水溶液冲洗进口管路，以防止流动相中的盐沉淀出来并堵塞进口管路。所有冲洗液和流动相应通过微过滤器(0.45 μ m或0.2 μ m)过滤，以去除细菌和有机碎片。
在冲洗系统并开始平衡色谱柱之后——在某些情况下可能需要3个小时或更长时间，这取决于色谱柱的类型和流动相的组成——你应该开始研究样品和参考溶液。在许多情况下，在制备这些溶液时，您需要采取特别的预防措施，例如减少暴露在光线或水分下，以防止分析物降解并产生错误的结果。这些特殊的注意事项通常在分析方法中提到。参考溶液和样品溶液还应通过称为注射器过滤器的特殊过滤器进行过滤(因为它们安装在注射器上)。但是，所使用的过滤器的类型和材料应与分析物和溶剂兼容，以避免吸附或污染。
现在是时候通过预先设置的仪器运行解决方案了。现代仪器是通过软件来运行的，软件可以帮助您创建操作方法和注射顺序。它允许您确定注射溶液的顺序、大小和注射次数。注射顺序通常在有关HPLC的分析方法或标准操作程序中说明。该序列通常从注入空白(溶剂)开始，然后注入一个或多个溶液，以证明包括色谱柱和流动相在内的HPLC系统的适用性。来自“系统适用性”溶液的几个参数，如分辨率或板计数，可帮助您确定色谱柱、流动相和HPLC仪器是否按方法要求共同工作。还建议通过重复注入其中一种参考溶液(5或6)来测试系统的可重复性。可重复性可以通过计算感兴趣的主峰区域的相对标准偏差来表示。
在这个阶段，您可能会遇到一些问题，需要在您的系统中进行更正。一般来说，故障排除技能对任何分析化学家来说都是非常重要的;获得这样的技能需要时间和耐心。以下是HPLC分析师面临的一些最常见的故障排除事件的摘要:
这一巨大的飞跃使该技术登上了分析方法的宝座。在分析药物、环境和食品样品的实验室中，您可以很容易地找到各种形状和品牌的HPLC设备，因为HPLC具有分析复杂混合物的卓越能力，而不需要广泛的样品制备步骤。
值得注意的是，术语液相色谱法包括几种技术，如薄层色谱法、制备色谱法和纸色谱法。本指南主要介绍高效液相色谱法(HPLC)，因为它是常规检测中最常用的技术。如果您了解仪器的原理和性质，但发现测试过程有点混乱，那么本指南可以帮助您在常规使用HPLC的快节奏实验室中找到方法。
准备进行液相色谱测试
分析型高效液相色谱法对初学者来说是难以应付的。这些方法通常都包含与实验每一步相关的信息和说明。熟悉实验室中HPLC方法的格式是很重要的，所以你可以很容易地找到你的方法。
大多数书面程序都以描述方法目的的介绍或范围开始。大多数说明该方法是否用于识别或定量活性成分或杂质，是否采用萃取或衍生化步骤制备样品，以及是否使用正相色谱或反相色谱。
后面是一项，说明该方法所需的仪器的确切特征和列的类型(如果需要，还有前列)。由于HPLC设备和色谱柱类型差异很大，这一项非常关键;它可能规定使用特定品牌的HPLC，特定检测器，或有关管道和注射环尺寸的特定属性。还有一节说明了操作参数以及制备流动相、参考(标准)溶液和测试样品溶液所需的化学物质。在许多方法中，你可能会发现另一节说明了一些关于各种溶液的制备和注射顺序的特殊说明和规则。
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选择您的高效液相色谱仪器和设置
一旦确定了必要的设备、色谱柱和化学品，下一步就是开始设置测试仪器。HPLC仪器的校准状态的检查是非常重要的。所选仪器必须成功通过所有校准测试;这通常通过在仪器上的贴纸或标签表示，说明上一次和下一次校准的结果和日期。进行校准测试，以确保仪器的每个部件都在适当的范围内工作。例如，必须检查泵的流量以匹配数字输入;对检测器、进样器和柱式加热器也进行了类似的试验。其目的是确保实验室中的所有仪器都在预定的误差范围内正常工作。
选择仪器后，必须清洗仪器并准备色谱柱。清洁步骤是很重要的，以清除任何残留的残留物从以前的工作;从而获得稳定的基线和准确的结果。许多方法都规定了在测试之前清洗系统的特殊顺序。一般来说，清洗程序包括先用自来水去除任何缓冲残留物，然后是纯甲醇或异丙醇/甲醇混合物。最后，50%的有机溶液冲过系统。最终冲洗溶液的组成很大程度上取决于所采用的色谱类型:反相或正相。该柱还根据其类型和要使用的流动相的组成进行冲洗。请参阅色谱柱的说明书，以确定适合色谱柱的最佳冲洗和储存方案。
HPLC测试用溶液的制备
首先要准备的解决方案通常是流动阶段。当使用梯度系统时，有时你需要为你的分析方法准备不止一个流动相。高效液相色谱级的水和溶剂是制备流动相的关键。
一旦准备好了移动相，就可以开始用相应的解决方案冲洗系统，并开始平衡色谱柱。大多数HPLC系统的性质是第四纪，即可以从四个不同的进口管道泵。如果要使用多条线(即方法涉及梯度)，那么通过每条线冲洗的最终溶液应该是与流动相兼容的溶剂。
例如，如果流动相具有高缓冲液含量，则必须用至少50%的水溶液冲洗进口管路，以防止流动相中的盐沉淀出来并堵塞进口管路。所有冲洗液和流动相应通过微过滤器(0.45 μ m或0.2 μ m)过滤，以去除细菌和有机碎片。
在冲洗系统并开始平衡色谱柱之后——在某些情况下可能需要3个小时或更长时间，这取决于色谱柱的类型和流动相的组成——你应该开始研究样品和参考溶液。在许多情况下，在制备这些溶液时，您需要采取特别的预防措施，例如减少暴露在光线或水分下，以防止分析物降解并产生错误的结果。这些特殊的注意事项通常在分析方法中提到。参考溶液和样品溶液还应通过称为注射器过滤器的特殊过滤器进行过滤(因为它们安装在注射器上)。但是，所使用的过滤器的类型和材料应与分析物和溶剂兼容，以避免吸附或污染。
运行系统适用性解决方案并排除系统故障
现在是时候通过预先设置的仪器运行解决方案了。现代仪器是通过软件来运行的，软件可以帮助您创建操作方法和注射顺序。它允许您确定注射溶液的顺序、大小和注射次数。注射顺序通常在有关HPLC的分析方法或标准操作程序中说明。该序列通常从注入空白(溶剂)开始，然后注入一个或多个溶液，以证明包括色谱柱和流动相在内的HPLC系统的适用性。来自“系统适用性”溶液的几个参数，如分辨率或板计数，可帮助您确定色谱柱、流动相和HPLC仪器是否按方法要求共同工作。还建议通过重复注入其中一种参考溶液(5或6)来测试系统的可重复性。可重复性可以通过计算感兴趣的主峰区域的相对标准偏差来表示。
在这个阶段，您可能会遇到一些问题，需要在您的系统中进行更正。一般来说，故障排除技能对任何分析化学家来说都是非常重要的;获得这样的技能需要时间和耐心。以下是HPLC分析师面临的一些最常见的故障排除事件的摘要:
- 低压、高压和不稳定压力:背压是系统运行最佳程度的重要指标。低压是一个连接泄漏的迹象，而高压是堵塞的迹象(这可能是由于溶剂的不兼容，如上所述)或恶化的色谱柱。压力不稳定主要是由系统中气泡的存在引起的。可能需要特殊的冲洗程序来清除气泡并恢复稳定状态。在一些系统中，不稳定的压力可能是内部部件磨损的迹象，如止回阀或排气块。
- 重复注射的可重复性差:这可以通过较高的相对标准偏差来证明。首先要检查的是注入器;脏的喷油器不能提供一致的结果。在其他情况下，小瓶溶液中气泡的存在可能是原因;一些方法建议在注射前对小瓶进行超声波，以去除任何气泡。
- 您试图检测的一对关键峰之间的分辨率丢失:保持相邻峰之间的分辨率对于高效液相色谱测试的成功至关重要，因为它允许准确测定不同的成分。分辨率的下降可能是由于色谱柱损坏，或者在某些情况下——特别是在梯度法中——仪器的梯度比例阀(GPV)故障造成的。
处理色谱图，计算并提交结果
一旦你确定你的系统工作正常，恢复注射顺序注入样品溶液。完成序列后，您可以使用特定的软件来处理获得的色谱图，以便绘制有意义的结果。有些软件程序允许你“整合”所有的峰值，不管它们有多小。计算每个峰值下的面积，生成的数字用于确定测试结果。
高效液相色谱实验后的计算主要有两种类型:首先，通过使用测定法确定一种或多种活性成分的含量，例如计算片剂中扑热息痛的含量。或者，您可能希望确定色谱剖面，即确定杂质的类型及其相对比例。在输入分子量和稀释因子后，目前的软件可以进行计算并生成最终报告。
最后，提交所有的文件和结果进行检查和批准。每个实验室都有自己的流程。
参考文献
1.高效液相色谱系统的发展。(无日期)。检索自http://www.labmanager.com/lab-product/2010/06/evolution-of-hplc-systems#.Wz22NvkzbIV
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