连续细胞培养的进展

显著的好处，技术障碍

连续细胞培养是生物加工向着高产、流线型和相互连接的单元操作的趋势的一部分。虽然从食品到消费品再到高科技电子产品，连续加工在各个行业都有着悠久的历史，但监管方面的担忧——有些是真实的，有些是自己造成的——阻碍了连续生物加工的广泛采用。随着制药行业，尤其是生物技术行业，开始适应监管机构对基于风险和科学的生产决策的渴望，这种情况正在开始改变。

早在2000年，荷兰代尔夫特大学的Andrzej I. Stankiewicz博士就写道化学工程进展，认为连续细胞培养是过程强化的一种类型。通常情况下，这个术语描述的是将操作合并、取消或以其他方式简化的过程，但Stankiewicz认为这个定义过于局限:“显然，在给定设备体积内生产能力的急剧增加，每吨产品能耗的逐步下降，甚至是废物或副产品形成的显著减少，都可以被称为过程集约化，”他写道。

Stankiewicz的想法已经在主流生物加工领域流行起来。Michael Phillips博士，MilliporeSigma (Darmstadt, Germany)下一代工艺研发总监，将连续细胞培养完全置于工艺强化中。菲利普斯说:“但由于监管和技术问题，这种技术的普及速度放慢了。”

细胞保留是关键

批次和喂食批次是最常见的哺乳动物细胞培养类型，无论规模大小。在批量培养中，细胞、培养基和营养物质被锁在生物反应器中长达三周，不添加或移除任何物质。分批补料培养是指在不同的时间间隔内添加营养物质，以延长培养时间并提高产量。在这两种情况下，产品都是在最后一批收获的。

在连续培养中，产品不断或定期灌注，不断添加新鲜的培养基和饲料，在许多情况下，细胞被排出，以保持健康、多产的细胞的优化群体。与批量培养相比，灌注培养在几个月的时间内对给定体积产生的产品数量惊人。

虽然一些商业生物工艺采用灌注细胞培养或连续纯化的某些方面(下游加工)，但对于已批准的生物制造工艺来说，端到端连续操作的目标仍然难以实现。

灌注培养由于其连续性和生产力，只对大规模工艺有意义，其中下游净化是专门为适应连续生产而设计的，或在这些工艺的缩小或发展模型中。

下游操作实际上可能是决定连续或批量细胞培养的决定性因素。Pall生命科学公司(Portsmouth, UK)下游处理高级营销总监Peter Levison指出:“净化必须与灌注培养的持续时间相同，并且或多或少是连续的。”“通过批量处理，澄清和单独的色谱步骤可能持续一天或更短时间。”在持续数周的连续加工过程中，制造商必须决定如何处理积累的产品。储存产品，直到足够数量的建立，以批量方式进行净化是一种方法。在理想的情况下(但尚未实现)，产品将不断地馈送到净化列车，在培养期间运行。

连续细胞培养越来越小……

与所有单元操作一样，连续细胞培养的优化取决于扩大和缩小规模的能力，以及开发人员对各种小规模模型的信任程度。然而，是否连续的决定通常是基于批处理过程的数据。

开发团队越早采用连续细胞培养，充分优化的潜力就越大。GE医疗(Marlborough, MA)应用技术集成高级经理Ken Clapp表示:“从最小的实际规模开始，在灌注模式下工作，有助于理解技术参数——哪些需要控制，哪些不需要控制。”

因此，越来越多的人希望细胞保留设备的尺寸适合台式电脑，与玻璃、不锈钢或一次性生物反应器配合良好，并在工艺开发人员习惯于工作的规模上提供工艺理解。“开发阶段会进行得更顺利，更快，成本更低，而不是等到50升。您将获得有关介质馈送、细胞出血、跨设备压力和细胞活力的更多信息。你当场就能得到答案。”克拉普补充道。

与批量培养一样，在连续细胞培养开发过程中，产量成为次要的工艺问题。工程师必须考虑保存装置的正确尺寸，再循环和细胞去除的类型和方式，如何在培养和收获之间建立安全连接，以及介质/饲料补充。克拉普说，所有这些都是为了设想无论最终规模如何，这一过程将会是什么样子。

由于连续培养需要不断补充培养基，生产和储存营养饲料减少了连续细胞培养的空间和占地面积优势。处理器必须权衡组成一个大批次的优势，还是安排许多小批量的组成。

.．.甚至更小

灌注细胞培养在制造规模的生物过程之外，或者在以制造为目标的实验模型中，通常是没有意义的。开发人员寻找几克用于表征或临床前研究的材料，只需通过批处理即可。

目前销售的大多数细胞保留系统都是在实验规模以上运行，但很少有低于2或3升容量的选择，这已经成为工艺开发培养的事实上的首选规模。然而，开发者很容易采用更小的留存设备，以更低的容量运行，从而进一步降低与单元、媒体和feed相关的开发成本。

自旋过滤器是一种细胞保留装置，它利用向心力将蛋白质排出细胞膜，同时保留细胞，实际上它的运行是在亚升级别。自旋过滤器已经存在多年了，供应商仍然在销售它们，这种设备在研究实验室中仍然很受欢迎。然而，对于希望进行大规模连续细胞培养的公司来说，自旋过滤器的缺点大于好处。

Applikon Biotechnology (Foster City, California)的营销总监John Poppleton解释说:“由于自旋过滤器无法大规模使用，因此将结果外推到实验规模之外是有问题的。优化它们也需要相当多的工作，而且旋转过滤器在使用一到三周后往往会堵塞。这就消除了长期灌注培养的大部分优势。”

随着生产规模的增长和生物技术的发展，在20世纪90年代早期，切向流过滤墨盒和后来的中空纤维系统成为了细胞保留设备的首选。克拉普说:“在实际理解方面，以及将这些设备与更小的生物反应器配对方面，当时发生了一些真正的突破。”“内部和外部过滤器在各种规模下都工作得很好，外部自旋过滤器的优点是在运行过程中可更换，使用蒸汽泄放/阻塞阀。这克服了过滤器类型方法的主要问题之一:堵塞。”

与传统的膜灌注装置不同，Applikon的Biosep细胞保留系统是一种无污垢过滤器，依靠声学将被捕获的细胞从溶解的蛋白质产物中分离出来。Biosep允许从灌注过程中连续收获，而保留装置将细胞保持在生物反应器内，每毫升约1亿个细胞的理想浓度。

Biosep服务于一个难以填补的利基，即非常小规模的灌注细胞培养，已成为放大和缩小研究的主流。除了服务于1000升/天的生产灌注规模和中试规模(200升/天)外，Biosep还涵盖了开发规模的低端，低至每天1升无细胞灌注，含产品的培养基。

连续细胞培养的监测和控制

自动化过程控制在所有商业细胞培养中都是非常需要的，特别是对于动态适应的连续过程。如果不恒定地测量pH值、细胞密度、溶解氧等，并基于这些参数进行自动化控制，灌注培养中营养饲料、细胞去除和收获率的优化就不可能实现。

这就是为什么Applikon将Aber Instruments (Aberystwyth, UK)的Futura电容传感器集成到其Biosep细胞保留设备中。Futura在线测量活细胞质量，从而实现灌注细胞培养的自动化。具体来说，Futura用于控制饲料和收获率。

许多正在使用或正在开发用于连续培养的传感器都是以批处理模式开始的。Stratophase(汉普郡，英国)传统上专注于闭环，实时，非采样系统，通过其Ranger®产品控制营养饲料添加到喂料批处理过程。Ranger根据代谢需要提供所需的营养物质。

Stratophase首席执行官Simon Saxby指出，与传统的传感器和控制器不同，Ranger不是依靠传统的pH值、溶解氧、细胞密度等测量，而是依靠培养基相对折射率的变化率来代替培养健康。在这样做的过程中，它增加了一个典型的不连续的细胞培养过程的连续性。

灌注培养呈现了一个更复杂的场景，因为保持其持续的关键操作包括收获(通过细胞保留装置自动发生)、细胞渗出和介质/饲料补充。

Saxby说:“连续过程的操作员倾向于依赖离线采样来确定下一时间段的进给率。”这种决定，比如每小时增加一升饲料，并没有考虑到新陈代谢的实时变化。在这方面，它与馈料批处理过程没有太大区别。具有自适应饲料控制应显著提高连续处理的输出，并允许细胞维持更长时间，在一个更健康，更富有成效的状态。

从Ranger系统的角度来看，在连续培养和批量培养中，通过按需喂食来维持稳定状态应该没有什么不同。“不同之处在于灌注过程中传感器的位置。”

Ranger的另一个优点是它不受反应容器设计、尺寸或结构材料的影响。这对于连续过程的放大和缩小是一个优势，这取决于所采用的技术，并不总是可靠地可预测，甚至是可能的。

安吉洛·德帕尔马，自由撰稿人，现居美国新泽西州牛顿市。