高通量LC-MS用于早期药物筛选和生物标志物检测
高通量筛选(HTS)，或快速筛选大型化合物文库的生物靶标活性，是药物发现过程的重要组成部分，特别是在早期阶段。有数百万种化合物有可能成为一种新药，如果没有目前的高温超导技术，在这些化合物中筛选出一些最有潜力的化合物(被称为药物先导)可能需要几个月的时间。这些最先进的技术使药物研究人员能够加速早期药物筛选过程，减少发现先导物所花费的时间，从而将更多的时间和精力用于优化这些先导物的疗效和安全性。
迅速进行大量化学试验并不局限于药物研发;研究人员将其应用于生物学和化学的许多不同领域。另一个例子是生物标记物检测。在这篇文章中，我们探索了两种基于液相色谱-质谱(LC-MS)分析的新型高通量分析方法，可以增强临床早期药物筛选和生物标志物检测。
LC-MS快速筛选药物结合
“质谱筛查方法的伟大之处在于，它们可以直接通过质量检测化合物，因此比其他只允许间接检测的技术更可靠，”他说Heather Desaire教授，美国堪萨斯大学化学系．“例如，大多数利用光来识别化合物的光谱技术都有间接检测方案，有时会干扰结果。”
此外，质谱法快速、选择性强、灵敏度高(只需要少量化合物)，可以同时检测多种化合物。但Desaire告诉我们，问题在于出现了错误的命中或失误。“当这些质谱分析被用于识别靶蛋白的潜在先导化合物时，它们存在很高的假阳性和假阴性率，这可能会导致药物开发周期后期的重大问题。”
为了找到解决这个问题的方法，Desaire和她的学生决定开发一种新的改进的质谱分析方法来探测铅化合物。他们的方法专注于检测一种很好电离的报告化合物，而不是检测铅本身，铅可能不会电离(1)。这样，研究人员就不会忽视任何潜在的不可电离的铅，导致假阴性——根据Desaire和Kasun Imaduwage博士的说法，他是论文的主要作者，详细介绍了新方法。
一种减少假阴性的审讯技巧
Desaire和Imaduwage的新技术在很大程度上依赖于一种“报告分子”——一种已知的、可电离的目标弱粘结剂，可以测量感兴趣的结合事件。报告者首先与固定化的靶蛋白孵育。一旦多余的报告物被洗掉，报告物-目标复合物被引入到一批库化合物中。如果文库中含有一个比报告基因更强的结合物，它就会争夺蛋白质中相同的结合位点，并将报告基因从复合物中取代。然后LC-MS用于离心后检测和测量移位的报告分子。
与对照样品相比，当高亲和粘结剂取代报告器时，报告器信号在检测过程中增加。(图1)通过这种方式，即使ms检测不到高亲和力配体，结合事件也是可测量的。“这是一种审问技术，我们通过仅检测报告分子来探测库批中强结合剂的存在，”Imaduwage说。
图1所示。Desaire和Imaduwage的新型高通量LC-MS筛选方法的实验流程。(来源:Imaduwage等人。科学。众议员2017）.
与这种方法相关的一个挑战是具有平衡解离常数(Kd)在微摩尔范围内。当目标蛋白的数量有限时，这变得尤其困难。另一个挑战与目标固定有关。Imaduwage解释说:“对于我们的实验来说，固定目标蛋白以从蛋白质配体复合物中分离未结合的化合物是非常重要的。”“然而，固定需要几个小时，而且有很多缺点。因此，不需要目标固定的自动化实验装置将是开发超高通量筛选分析的一种有前途的方法。”Desaire的团队认为，使用先进的膜过滤器可以解决这个问题。
Imaduwage说:“最有趣的结果是发现了一种新的碳酸酐酶(CA)抑制剂pifthrin-µ。”“考虑到CA抑制剂是治疗多种疾病的有治疗价值的药物，这是一个重要的结果。”他接着解释说，pif菊酯- μ不能被其他使用电子喷雾电离质谱(ESI-MS)的HTS检测到，因为它是不可电离的。“可以说，这可能就是氰菊酯一直不为人知的原因。到目前为止，它还没有被确定为CA抑制剂，尽管其他科学家已经通过使用CA作为靶蛋白，在基于ms的HTS试验中筛选了超过10万种化合物。”
最后，Desaire强调，时间并不总是决定一种方法对高温ts有多好，特别是在目前不同样品制备和分离技术的可用性下。“有效的高温ts检测应该适用于不同类别的化合物。它应该更快，因为不同的化合物在相同的运行/批次中进行分析，而不是在重复运行中。”
因此，选择符合所有这些因素的分析方法是至关重要的，正如Desaire所说，这完全取决于研究人员根据所需实验的要求来决定适当的技术。
一种监测酒精滥用的高通量方法
临床医生使用几种不同的生物标记物来检测患者的酒精滥用，其中磷脂酰乙醇(PEth)名列前茅(2)。自2006年引入临床以来，PEth因其较高的临床特异性和敏感性以及较长的检测窗口期而很容易被用于跟踪酒精消费。PEth的临床特异性和敏感性均高于常用方法酒精标记，如CDT或γ - gt；由于它是一种乙醇代谢物，理论上特异性为100%。Anders Isaksson，瑞典隆德大学临床化学与药理学学系副教授．“它可以用于酒精使用障碍的诊断、随访和治疗评估”(图2)。
图2。在正常条件下，磷脂酶D (PLD)将磷脂酰胆碱(PC)水解为磷脂酰和胆碱，但在乙醇存在的情况下，PLD催化PC转磷脂酰化成相应的磷脂酰乙醇(PEth)同源物。(来源:Isaksson等人，JALM, AACC 2018）.
Isaksson指出，在过去几年里，送到他的实验室测试PEth的样本数量稳步增加，促使他开发出一种高通量分析屏幕，这种屏幕也具有成本效益和可靠性。他解释说:“我们需要一种比我们之前基于蒸发光散射检测的hplc方法具有更高通量和分析/临床敏感性的分析方法。”“由于样本量大，涉及体力劳动，我们希望创建一个可以自动化的样本检查。”
Isaksson的团队在去年(3)发表了一种液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法，可以在3分钟内确定PEth的存在。在开发过程中，面临的挑战是将样品检查(包括蛋白质沉淀/提取步骤)转换为具有足够分析灵敏度和选择性的自动化程序。隆德大学的研究人员成功地完成了他们的努力，并证明了他们的方法非常适合于每年接收>万个临床样本的高容量临床实验室。
“我们的方法使用了一种自动化的样本检查，只有很少的人为干预，它是稳健的，具有很高的容量。自2013年控制程序启动以来，外部质量样本显示出与所有样本的方法平均值相比的标准偏差< 2 SD，”Isaksson兴奋地说。然而，他补充说，该方法的标准化还不完整，因为它需要获得认证的参考材料，而目前还无法获得。
参考文献
1.Imaduwage, K. P.;Lakbub, j .;去吧，e.p.;Desaire, H.，基于快速LC-MS的高通量筛选方法，提供无假阳性或假阴性，确定了一种新的碳酸酐酶抑制剂。科学通报，2017,27(1)，344 - 344。
2.祝,g;Boscolo-Berto r;Cecchetto g;做,p;Nalesso, a;血液中的磷脂酰乙醇作为慢性酒精使用的标志:系统回顾和荟萃分析。中国生物医学工程学报，2012,29(4)，457 - 457。
3.法甲,a;沃尔特,l;汉森,t;安德森,a;联络小巷,j .;使用简单的自动提取程序-分析前和分析条件测定临床样品中酒精使用生物标志物磷脂酰乙醇的高通量LC-MS/MS方法。应用检验医学杂志，2018,2(6)880-892。
