药物发现的高通量筛选方法

药物开发是一个漫长而昂贵的过程。一个研究报道于美国医学协会杂志研究发现，在2009年至2018年期间，一种药物需要的平均投资才能通过市场审批发展管道为获得监管机构的批准，该公司投资了13亿美元。巨额支出的原因之一是药物失败率高。研究发表在自然生物技术2003年至2011年间，90%进入临床试验的药物未能获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准。多年来，制药行业的研发生产率一直在下降，这反过来又加剧了未得到满足的临床需求。在这篇文章中，我们将讨论如何使用不同的高通量筛选(HTS)方法来帮助加速药物发现过程。

由于可用于筛选的化合物数量众多，制药公司一直在采用HTS方法，可以快速、低成本地筛选其化学文库，以确定对特定生物靶标具有活性的最有前途的化合物。高温超导通常涉及到使用自动化(例如，液体处理机器人)，小型化如1536孔板格式和大规模数据分析等纳入人工智能。

“几十年来，高温超导一直是药物研发行业的主要产品。它可以在非常专门的生化分析中自动分析药物活性。然而，到目前为止，这些有意设计的测定方法的读数仅限于极少数的靶标，”他说叶朝阳博士他为HTS开发了一种具有成本效益的RNA测序方案。

在接下来的章节中，将重点介绍新开发的HTS平台用于支持药物发现。

通过成像读出荧光

基于荧光的分析是一种在高通量环境下可视化特定化合物的生物反应的方便方法。根据荧光强度，还可以确定生物活性的程度。可以设计荧光分析，以便在产生或消除目标分子时发射或淬灭信号。最近,塞西莉亚Eydoux他是哈佛大学的研究工程师AFMB实验室和同事创建基于荧光的HTS检测严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV) RNA合成复合物。这个复合体是由由于它与SARS-CoV-2高度同源，因此有潜力作为一种设计蛋白质合成抑制剂的手段。利用已知的蛋白质相互作用，研究小组创建了一种检测方法，当nsp-7/8与nsp-12(一种依赖RNA的RNA聚合酶)结合时，荧光染料将插入双链RNA以产生荧光信号。

研究人员通过筛选来自普雷斯特维克化学库的1520种fda批准的化合物来验证他们的检测方法^®。该化合物库因其高度的化学和药理多样性以及已知的人类生物利用度和安全性而被选中。在自动液体处理机器人的帮助下进行筛选，并使用平板阅读器进行荧光读出。根据30%的抑制截断值，候选药物属于蒽环类和四环素类，计算的命中率为3%。

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质谱分析

化学发光和荧光读数的一个局限性是它是生物活性的间接测量。Andreas Luippold博士等最近发达采用HTS方法质谱分析。作者认为，质谱是一种无标签技术，提供了直接底物到产物转化的证据，这与药物发现更有生理意义。这个方法也有风险降低复合干扰可能导致假阳性和假阴性，它不需要定制的信号介质来放大信号，如荧光读数。然而，到目前为止，将质谱与液体处理机器人集成一直具有挑战性，质谱仪中使用的缓冲液也可能是不兼容的保存蛋白质的酶活性。

Luippold及其同事配置了基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)设备，并为其安装了液体处理机器人，使其与1536孔板(或4 x 384孔板)兼容。这使得从检测板和基质溶液中稳健和可重复地将样品转移到MALDI靶板上，使他们能够筛选约4900个针对蛋白质酪氨酸磷酸酶1B的抑制剂库-蛋白质酪氨酸磷酸酶1B是一种已知的治疗靶点糖尿病和肥胖。作者还将他们的方法与生化分析和自动斑点技术进行了直接比较。为了生成100万个数据点(即筛选100万个化合物/分子片段)，MALDI-TOF HTS方法只需5.1天，而生物化学检测需要11天，自动标记技术需要7天。

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电池系统

影响中枢神经系统的疾病正在上升故障率高在CNS候选药物中仍然存在，因为它们无法通过血脑屏障(BBB)。中枢神经系统药物的成功率是只有7%大概需要10.5年开发这一领域的治疗方法，这比其他疾病要长得多。Elisa Moya博士阿图瓦大学(University of Artois)的研究人员和同事们最近发达一个小型在体外在开始昂贵的临床前研究之前，血脑屏障模型研究药物毒性和血脑屏障渗透率对早期药物发现的影响。

Moya强调了HTS在这方面的一些优势:“在BBB中在体外在临床前研究阶段，HTS的发展是至关重要的，原因有很多。例如，它使研究人员能够快速评估大量药物/化合物，并且更好地适应CNS化合物发现早期药物发现所需的高产量。”她还指出，他们的方法减少了材料和塑料浪费，并使研究人员能够在早期筛选出较弱的候选材料，从而减少了所需的进一步测试量在活的有机体内模型。

"基于一个获得专利的成熟人类在体外由阿图瓦大学创建的BBB模型，我们开发了一个小型化和自动化的复制。复制使用了96口井的系统格式，并结合了自动化技术。”

该团队创造了人类血脑屏障在体外使用从人脐带血中分离的CD34+造血干细胞衍生的内皮细胞，并将不同数量的细胞接种到96孔板中。周细胞，血脑屏障的主要细胞类型，也被播种在孔板的底部。然后，作者通过分析荧光细胞旁标记物荧光素钠通过内皮细胞层的转运来评估血脑屏障的完整性。当Moya和同事比较人工和机器人创建的血脑屏障完整性时，它们在不同的井板格式中具有可比性，这表明形成了一个紧密的网络。共聚焦成像也证实了机器人接种的血脑屏障中粘附连接蛋白如钙粘蛋白和紧密连接蛋白如claudin-5的存在。

接下来，研究小组筛选了一组药物，如安非他酮谁知道人类大脑/血浆的游离/游离比值在活的有机体内。结果表明，使用小型化血脑b模型测试的各自药物的自由/非结合分数比与在活的有机体内在人类的数据，强相关性(R²= 0.8808)。当Moya等人测试他们的小型化模型的血脑屏障完整性时，他们还发现神经毒性药物像鱼藤酮极大地破坏了血脑屏障，而血脑屏障的完整性不受对乙酰氨基酚等非神经毒性化合物的影响，进一步加强了他们模型的生理相关性。

“我们已经证明了在体外“BBB模型能够获得预测结果，适用于药物化合物的HTS，”Moya补充道。虽然他们的模型的实用性已经得到了证明，但重要的是要注意一些关键的局限性，包括只包含两种单元类型和缺乏动态流环境。

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RNA序列

RNA测序是了解药物作用的有力方法。这种方法使用RNA转录组作为代理，但目前可用的技术通常是低通量、昂贵和人力密集型的。叶朝阳博士及其同事为HTS开发了一种具有成本效益的RNA测序方案DRUGseq通过放弃漫长的RNA纯化步骤和采用多路复用策略。在药物治疗后，细胞被裂解，mrna被直接反转录(RT)。该团队还在RT引物中引入了特定的条形码，使他们能够从单个井中汇集cdna，并减少多井处理所需的劳动力。

为了进一步减少所涉及的时间和成本，Ye和同事们还测试了降低读取深度对检测到的基因数量的影响，以及药物治疗后捕获差异表达基因的准确性。DRUGseq文库以200万和1300万reads/well进行测序，而传统的每个样品为4200万reads/well，即使在较浅的reads深度，各井的基因表达也是一致的。

接下来，该团队使用DRUGseq筛选了433种已知靶点的化合物库。通过DRUGseq检测到的差异表达基因的数量与来自连接图尽管使用了不同的技术平台，但这是一个由药物治疗引起的细胞扰动的大型数据集。

最后，作者使用DRUGseq比较了CRISPR敲除和一种经过充分验证的化合物环己亚胺对RPL6的复合抑制的效果。他们发现，虽然CRISPR治疗降低了RPL6而环己亚胺则没有。然而，与DMSO处理和非靶向对照样品相比，发现这两种处理的转录组谱在机制上更相似，并且聚类在一起。作者最后强调了DRUGseq相对于竞争平台的优势，例如PLATE-seq具有较低的吞吐量和计算偏差。

“这项工作可以实现数百到数千个井中数千个基因的转录分析，并且它与工业环境中现有的化合物筛选自动化兼容。挑战在于，它需要预先投资筛选自动化，才能真正具有成本效益。通过测试各种反应条件，转录本捕获效率也可以提高，这将提高检测灵敏度，降低每口井的测序成本。”

他继续说:“我们希望未来有更多的实验室采用和改进这项技术。作为原研究的延续，最近手稿已经提交给bioRxiv我的同事对平台进行了更严格的测试，并将分析工作流程向公众开放。”

结论

药物发现成功率的持续下降将导致临床需求得不到满足，药物价格也会更高，因为制药公司会寻求收回其研发投资。HTS是一种快速有效地筛选大量复合库的策略。传统方法如荧光读出和细胞培养模型可以与自动化成像系统、液体处理机器人和小型化集成，但通常依赖于生物活性的间接测量，而质谱仪可以集成到HTS工作流程中，以促进分子片段和活性的直接测量。最后，随着测序技术的快速发展，具有HTS能力的RNA测序有望成为新型化合物机理研究、化合物再利用和利用CRISPR基因编辑鉴定遗传转录网络的有力工具。