生物制药中的宿主细胞蛋白分析

HCPs:生物制药中不可避免的杂质

今天生物治疗的很大一部分是重组DNA技术的成果。在生物制药生产中，蛋白质药物在精心选择和工程的宿主细胞系统中以高浓度表达，如哺乳动物细胞(CHO)，大肠杆菌酵母或植物细胞。

然后，产品经过复杂的纯化步骤，以去除宿主系统的所有细胞成分。然而，宿主细胞在生产过程中表达的大量其他蛋白质很容易污染药物，并在纯化过程中被遗留下来，使宿主细胞蛋白(HCPs)成为残留的过程相关杂质。

最终产品中HCP污染物的存在，即使是非常低的水平(1- 100ppm)，也可能在人体中引发不可预测的严重免疫原性反应。因此，在生物治疗开发过程中准确检测、识别和量化HCPs对于确保患者安全至关重要，并且是一项监管要求。为了符合这些规定，必须采用先进的纯化和分析方法。

HCP分析的重要性和挑战

生物制品中HCPs的存在被认为是关键质量属性(CQA)，¹从而使它们从产品中清除成为一个基准，以证明一个强大的生物过程。

这一主要的过程衍生杂质组构成具有不同物理化学和免疫特性的复杂混合物。药品中的HCP主要以三种方式威胁患者安全和产品的疗效:

a) HCPs即使在最低浓度下也具有免疫原性，因为它们对人体是外来的。

b)具有蛋白水解活性的HCPs如果没有被充分去除或灭活，会导致蛋白质产物的破碎，并显著降低产物的产量、稳定性和功效。

c) HCPs聚集形成各种大小的可溶性或不可溶性聚集物是一个潜在的问题，因为这些聚集物在给药时可能引起不良反应，并作为佐剂加剧对药物的免疫反应。²

根据安妮·德·格鲁特教授的说法罗德岛大学免疫学与信息学研究所，与HCP通关相关的独特挑战包括:

a) HCPs作为杂质的异质性和复杂性，使其有别于其他单一分析物杂质。虽然可能有数千种蛋白质需要监测，但尚不清楚这些蛋白质中有多少表达，哪些蛋白质倾向于与产物共纯化，因为它们的物理性质不同，如分子量、等电点和疏水性，并且可以经历不同的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化和截断。^3.

b) HCP与生化性质相似的产物共纯化或HCP与产物直接相互作用。HCPs的这种“搭便车”倾向是产品和/或过程特定的。在蛋白A层析的捕获步骤中，HCPs与蛋白质产物共纯化的范围通常为200ppm至3000ppm，但已报道的值高达70000 ppm。⁴HCP与药品之间的其他相互作用尚未完全阐明。分析必须能够基于进入纯化阶段的HCP起始种群同时对数百到数千个分析物进行非常广泛的抽样。

监管指引

目前还没有指导方针规定产品中HCP的确切可接受限度。一家跨国生物制药公司的方法开发专家Keshavamurthy Prakash博士解释说，根据目前可用的分析技术，考虑到这种杂质和分析方法的复杂性和可变性，设置一个全行业的数值阈值是具有挑战性的，如果不是不可能的话。

通常，生物技术产品的HCP含量预计低于100ng /mg。卫生当局根据具体情况评估可接受的HCP水平，并根据临床发展阶段、患者群体、给药途径、剂量和产品作用方式等因素作出决定。使用风险评估对于为每种产品设定HCP限值是至关重要的。⁴

第Q6B节(生物技术产品规范)和Q11节(原料药的开发和制造)国际协调准则会议 ⁵处理工艺相关杂质，规定必须监测HCP杂质并将其降低到可接受的水平，以确保产品质量和患者安全。这两个我们 ⁶而且欧洲药典 ⁷已经出版了总论章节，概述了开发和验证HCP测定的最佳实践。的食品及药物管理局 ⁸尽可能使用高灵敏度的分析方法，期望回收和净化过程中引入的污染物低于可检测的水平。欧洲药品管理局(EMA)指南CPMP/BWP/382/97 ⁹总结了残留HCP必须使用合适的分析方法进行常规检测和监测，以便结果一致并满足规范限制。其他国家的监管机构对HCP控制有自己的规定，但一般认为，根据ICH指南，需要一种敏感的、经过验证的方法来监测残留HCP。

分析技术

在工艺开发和制造过程中，选择合适的方法来识别和量化HCP一直是一个值得关注的问题。在整个生物技术行业，免疫特异性分析(如ELISA)、免疫印迹法以及非特异性方法(如1D和2D电泳、2D色谱和MS)一直是HCP监测的主要方法。近年来，诸如表面等离子体共振(SPR)等评价技术为HCP分析提供了更加灵敏、高效和简化的过程。¹⁰

虽然HCPs的起始群体通常在相同平台细胞培养过程中产生的产品中相对一致，但在纯化程序的每一步中存在的这些蛋白质的组成和数量可能有很大差异。测定报告的值，代表聚合HCP含量，是高度试剂(例如，抗体制备)和方法(ELISA vs MS)特异性的。此外，由于化验标准因实验室而异，在不同化验/实验室测试的同一样品可能产生不同的HCP值。

Immunospecific方法

ELISA

由于其简单、快速和敏感，抗hcp酶联免疫吸附试验(ELISA)被认为是分析hcp的金标准。¹该方法是利用针对宿主细胞的多克隆抗体开发的，提供了相对较高的通量和敏感的定量。HCP-ELISA可能需要几个月的时间来开发，通常能够检测大多数hcp，特别是高丰度或高免疫原性蛋白。然而，“大多数”并不足以保证最终产品的安全性，因为未检测到的免疫原性蛋白可能会引发严重的反应。

西方墨点法

使用为HCP‐ELISA生成的多克隆抗体混合物的Western blot分析可以证明在不同的下游过程池中存在丰富的HCP，也可以突出样品之间的差异。当HCP-ELISA显示样本中存在HCPs时，一维western blot也非常有助于进一步表征样本中的HCPs。Western blots可用于显示是一个HCP大量存在还是10个HCP低丰度存在。¹¹

这些过程特异性免疫分析虽然被广泛使用，但需要事先了解HCP污染物的性质，开发费时且昂贵。因此，它们不能很容易地适应于充分评估来自不同细胞类型和纯化方案的生物制药产品。¹²

正交方法

正交检测和监测技术，如LC-MS/MS和2D-DIGE已成为流行的补充ELISA方法。这些非特异性方法能够完全检测和表征生物制剂中的HCP，并且可以直接从获得的数据中提供单个蛋白质的身份信息，而不仅仅是HCP总数的数字，这是目前基于ELISA的方法的一个局限性。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‐PAGE)基于的方法用于评估HCP杂质是直接和快速的。SDS‐PAGE凝胶可重载10-50µg产品，并结合敏感的总蛋白染色，如SyproRuby，银染色，或其他类似的技术。这种强大的正交方法可以检测HCP ELISA中不反应的HCPs，尽管灵敏度限制为每HCP杂质/mg产品~100 ng。¹尽管如此，这是一个相对简单的最终净化池检查，以确保净化过程按预期执行。此外，1D SDS‐PAGE与用于HCP表征的非常强大的质谱技术兼容。

在一个2d -聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，复杂的蛋白质混合物根据其理化性质进行分离，染色和可视化。然而，2D-PAGE定量HCPs受到其狭窄动态范围的限制。低丰度的HCPs不能被检测到，重组蛋白的存在往往掩盖了可见性，因此，损害了这些HCPs的可检测性。¹²此外，具有类似单抗物理性质的HCPs不容易用2d凝胶分离，即使在用质谱定量时它是最终原料药中的主要杂质。⁴

二维差分凝胶电泳(2D DIGE)， 2d凝胶电泳的扩展可以使用光谱可分辨的，尺寸和电荷匹配的荧光染料在同一凝胶上解析多个样品。样品多路复用的能力和内部标准的包含为2D-DIGE提供了更高的蛋白质定量进行比较分析的准确性。然而，这些方法只是半定量的，具有有限的动态范围(两到三个数量级)，并且需要额外的技术(例如，质谱)来识别HCP。^3.

质谱(MS)成为领先的蛋白质组学分析技术，可以检测和量化低丰度HCPs，在重组产物存在时具有较高的置信度。^13、14、15串联质谱(MS/MS)通常与液相色谱(LC)相结合，以高通量的方式快速监测和识别多种蛋白质分析物。一旦建立了MS方案，免疫原性和有问题的HCPs也可以在高度纯化的样品中靶向。¹¹因此，随着这项技术的不断改进，许多以前被忽视的商业生物制品中的HCPs可能会被表征出来。¹⁶尽管如此，操作LC-MS/MS需要高技能的人员。该设备很昂贵，而且单个HCPs的绝对定量需要使用成本和劳动密集型的合成肽。随后的肽验证工作也仍然是一个挑战。¹⁷

未来的视角

为了建立整个过程中HCP杂质的完整图像，并实施可靠的HCP去除策略，使用多维HCP分析是必要的。MS在新功能、更直观的软件和更易于使用方面继续发展，并有望在HCP分析中发挥越来越大的作用。随着通过这些技术获得的数据量的增加，测量和监测数千种蛋白质的能力也在增长。

HCP分析的未来包括开发改进的风险管理和评估方法，通过利用信息来确定关键的HCP和多种风险因素的累积知识。¹⁸目前正在开发一种网络工具，使用这种数据库来预测基于cho的产品的HCP的免疫原性。¹⁹看看这些工具如何用于个别治疗项目将是很有趣的，特别是如果治疗中存在一些以良好的临床安全性为特征的HCPs，可以进行调查。

引用:

1.Krawitz, Denise等人。生物治疗中残留宿主细胞蛋白杂质的表征生物治疗学分析表征(2017):211-237。

2.Vanderlaan, Martin等人。生物制药中宿主细胞蛋白杂质的经验生物技术进展(2018年)。

3.Jin, Mi，等。“通过二维差异凝胶电泳(2D - DIGE)分析宿主细胞蛋白质:对下游工艺发展的影响。”生物技术与生物工程105.2(2010):306-316。

4.王，凤强，黛西·理查森和穆罕默德·沙米姆。“宿主细胞蛋白质的测量和控制。”生物危害杂志28.6(2015):32-38。

5.ICH协调的三方指南，“规范:生物技术/生物产品的试验程序和验收标准- q6b”，(1999)http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q6B/Step4/Q6B_Guideline.pdf

6.美国药典39，国家处方34，“<1132>剩余宿主细胞蛋白在生物制药中的测量”，(2016)https://www.usp.org/sites/default/files/usp/document/our-work/biologics/USPNF810G-GC-1132-2017-01.pdf

7.欧洲药典，27.2期，“2.6.34。宿主细胞蛋白质测定”，(2015)http://www.e-gmp.pl/wp-content/uploads/2015/05/2.6.34.-Host-cell-protein-assays-draft.pdf

8.FDA，“在人用单克隆产品的制造和测试中应考虑的要点”(1997)，www.fda.gov下载/ BiologicsBloodVaccines GuidanceComplianceRegulatory-Information / OtherRecommendationsfor-Manufacturers / UCM153182.pd

9.欧洲药品评估机构人类药品评估部门，伦敦，1997年6月10日，CPMP/BWP/382/97，www.ema.europa.eu / docs / en_GB / document_library / Scientific_guideline / 2009/09 / WC500003322.pdf

10.Lundström, Christine Sund，等。用于宿主细胞蛋白质分析和疫苗过程中杂质筛选的抗体评价的敏感方法疫苗32.24(2014):2911-2915。

11.Tscheliessnig, Anne Luise，等，“治疗性蛋白质生物加工中的宿主细胞蛋白质分析-方法和应用”。淡水生物学，Wiley/Blackwell (10.1111)， 22 feb 2013, onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/biot.201200018。

12.Zhu‐Shimoni, Judith，等。用elisa法和正交法检测宿主细胞蛋白生物技术与生物工程111.12(2014):2367-2379。

13.Ahluwalia, Deepti，等。治疗性蛋白P1中宿主细胞蛋白杂质的鉴定药物与生物医学分析141(2017):32-38。

14.列维，尼古拉斯E.等人。单克隆抗体生物处理中宿主细胞蛋白产物相关杂质的鉴定和表征生物技术与生物工程111.5 (2014):904-912

15.张庆春，等。“在单克隆抗体纯化过程中使用质谱全面跟踪宿主细胞蛋白。”马伯。卷。6。3号。泰勒和弗朗西斯，2014年。

16.马德森，詹姆斯A.等。“通过亲和消耗，LC-MS/MS和多变量分析，在生物治疗中对宿主细胞蛋白进行完整的描述。”马伯。卷。7。6号。泰勒和弗朗西斯，2015年。

17.Doneanu, Catalin E.，等。“使用离子迁移质谱结合多维液相色谱法，在低至1ppm的高纯单克隆抗体中增强检测低丰度宿主细胞蛋白杂质。”分析化学87.20 (2015):10283-10291

18.Bracewell, Daniel G.等，“宿主细胞蛋白(HCP)在工艺开发和制造过程中的识别与基于风险的控制管理相关的未来。”淡水生物学，Wiley/Blackwell(10.1111)， 2015年7月14日，onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/bit.25628。

19.Bailey‐Kellogg, Chris等。“CHOPPI:基于CHO的蛋白质生产中宿主细胞蛋白质免疫原性风险分析的网络工具。”生物技术与生物工程111.11(2014):2170-2182。