生物制药工业中的液相色谱

在寻找治疗和预防COVID-19的药物的过程中，人们重新利用了瑞德西韦等现有小分子药物，并开发了一些新的药物药物而且疫苗．¹许多新的治疗方法都是生物制药这个词出现于1982年．²这些生物制剂或大分子药物，如治疗蛋白、单克隆抗体、寡核苷酸和抗体-药物偶联物，已成为治疗各种疾病的宝贵工具。这包括癌症，类风湿关节炎银屑病，有效的小分子疗法有限或没有。

与化学制造的小分子药物不同，生物制药来自活细胞(微生物、动物、植物或人类)。复杂的制造过程会导致目标分子结构的异质性或变异，从而影响分子的有效性、安全性和稳定性。因此，为了确保正确的化合物形成所需的纯度，不断监测过程以及产品的质量是必不可少的。这涉及到从该过程中获得的变体的深入描述。此外，药品和/或制剂在生产过程中与宿主细胞蛋白或在储存或运输过程中形成的目标分子的分子片段或聚集物的污染需要定期分析。

此外，大量“负担得起”的生物仿制药(预计与创新者的产品相同)也需要进行测试，以评估它们与原始产品或参考产品的相似性、质量和功效。生物药物的不同给药途径影响其药代动力学，因此在体液中监测治疗药物变得重要。

液相色谱法如何应用于生物制药?

而液相色谱法(LC)与质谱分析(女士)(质)是一种强大且常用的技术，用于在药物开发过程中对生物药物进行表征，LC与可见-紫外可见)/光电二极管阵列(PDA)，荧光和光散射探测器用于常规分析。已经开发了各种LC方法来评估这些分子的关键质量属性，例如生物治疗分子的纯度和化学修饰，聚集和电荷变体，以及在复杂矩阵中量化它们并确保杂质的缺失。下面列出了一些此类方法的示例:

• 肽图这是一个完善的技术吗鉴定蛋白质，监测其结构完整性，并确定初级结构中的任何氨基酸修饰。它涉及到消化用酶(如胰蛋白酶)消化蛋白质，后面跟着s其碎片的分离和鉴定。一种利用反相色谱(RP)或RP-高效液相色谱(HPLC)结合紫外检测的快速肽定位方法已经开发出来，用于估计单克隆抗体的位点特异性氧化。^3.
• 凝胶排阻层析法(SEC)用于根据溶液中的分子大小或分子量来分离分子。带有紫外线或光散射检测的SEC是研究蛋白质和抗体中的聚集，或在制造或后续处理过程中分子的解体的选择技术。建立了一种用于病毒疫苗和病毒样颗粒(VLPs)质量控制的SE-HPLC方法。⁴
• 离子交换色谱法（IEX)，可侦测电荷变异的存在。IEX还有助于科学家了解蛋白质在原生状态下的相互作用。⁵
• 疏水相互作用色谱法(HIC)通过利用生物分子的疏水性来分离它们来纯化生物分子。该技术已应用于从其他异构体中分离药物级超卷曲质粒DNA。⁶HIC结合反相高效液相色谱法进行分析抗体药物配合．⁷
• 液相色谱技术，如RPLC, HIC, SEC和多维分离已用于确定药物-抗体比，评估药物负载分布和分析抗体-药物偶联物中的工艺相关杂质。⁸
• lc分离后，用荧光或质谱分析来表征附着在单克隆抗体上的聚糖或糖。⁹
• LC-MS通常用于分析生物制剂中的翻译后修饰，如蛋氨酸氧化或脱酰胺。最近的一项研究使用了非靶向lc -高分辨率(HR)质谱，通过差分分析检测单克隆抗体的整体转化。¹⁰
• 亲和层析是基于生物分子及其配体之间的特定相互作用，用于它们的分离和滴度(浓度)测定。¹¹
• 高效液相色谱法已被证明适用于生物仿制药的常规依从性测试。¹²
• 除了一维LC (1D-LC)和二维LC (2D-LC)，将在线样品制备与使用同一LC系统的多级分析相结合的多维LC (mD-LC)正在开发用于生物制药分析。¹³
  
  

液相色谱法在生物制药工业中有许多不同的应用。

除了表征和定量生物疗法，LC还被应用于辅料的分析，¹⁴杂质，如从预充注射器中收集的治疗性蛋白质配方中的浸出硅油，¹⁵以及生物制剂的提纯。¹⁶

色谱法在药物分析中的意义是什么?

在生产过程中，生物制药的结构容易发生变化。例如，在细胞培养过程中，蛋白质结构可以通过以下方法进行修改:

• 氨基酸残基的甲基化、磷酸化或糖基化
• 二硫加扰
• 脱酰氨基作用
• c端赖氨酸或精氨酸裂解

这就需要将不同的变体以及介质和杂质分开。LC是实现这一目的的有效工具。此外，大多数生物制药都具有紫外线活性或具有发色团，这使它们易于被UV- vis /PDA检测器检测。使用反相高效液相色谱法来确定蛋白质的一级结构消除了执行耗时的需要埃德曼降解确定氨基酸序列。与常规的抗体分析技术相比，如酶联免疫吸附试验(ELISA)高效液相色谱具有检出限低、定量分析适用性强、重现性好等优点。此外，不像ELISA那样依赖于抗体的可用性。用LC鉴定疫苗是昂贵和耗时的动物试验、ELISA或分析超离心的可行替代方法。

高效液相色谱仪器在大多数实验室的可用性，易于操作和维护使色谱法成为常规分析的理想技术。上述LC的形式范围使其适用于表征生物制药的不同方面。采用超高效液相色谱法(UHPLC)，可以提高分析速度;进一步提供bio-inertUHPLC组件的版本使其成为生物制药快速和常规分析的理想选择．

是什么使得生物制药样品对LC具有挑战性?

生物制药的分析提出了独特的挑战，因为它们:

A)与小分子药物相比，体积相对较大

B)物理特性，如蛋白质和肽分子的多重电荷态

c)微异质性

这就需要使用多种正交技术来完成表征。一些可能影响药物安全性和效力的结构变异可能在低浓度时存在。因此，分离低丰度蛋白的样品制备是生物制药分析的关键步骤。有时，新型生物制药药物可能需要从头开始评估，因为文献中可能只有很少的信息。这可能需要使用通用探测器，如质谱仪进行初步评估。此外，可能需要补充技术来检测非紫外线吸收修饰物、杂质或辅料。

虽然高效液相色谱法是成熟生物制药常规分析的理想方法，但为了确保更好的色谱，必须考虑一些因素。为了尽量减少或消除生物分子与流道的粘附以及与金属离子(特别是铁或钢)的相互作用，建议按照标准操作程序(SOP)或使用生物惰性高效液相色谱系统对流道进行周期性钝化。除了保持分子的完整性外，生物惰性系统的使用还消除了由于长期暴露在高盐浓度或高ph值的缓冲液中而导致的样品流道中的金属成分的腐蚀。这些系统的样品流道由惰性材料制成，如钛、聚醚醚酮(聚醚醚酮，一种工程塑料)或陶瓷，这些材料抗氧化和腐蚀。

对于生物制药分析，不同类型的分析需要具有适当化学性质和尺寸的色谱柱。RP柱具有较大的孔径和短的烷基链，建议用于完整的蛋白质分析，而SEC和IEX柱分别用于尺寸排除和离子交换色谱应用。亲水相互作用液相色谱(HILIC)柱是聚糖分析的首选，肽图谱是使用C18-RP柱完成的。对于几乎所有这些应用，生物惰性色谱柱可用于减少非特异性结合和提高重复性。

优化色谱参数，如流速，以达到良好的分辨率和灵敏度;调节流动相的离子强度和pH值，确保分析物的溶解度，最大限度地减少它们与柱上的自由硅醇基团的相互作用，并保持生物分子的活性。保持最佳柱温很重要，因为生物分子在高温下容易变性。SEC柱必须用已知尺寸和重量的适当标准进行校准。灵敏的检测器需要检测和识别低丰度的蛋白质和微小的修饰。

结论

LC格式和色谱柱性质的多样性(包括RP、SEC、IEX、HILIC、HIC、亲和力或制备性)以及与各种检测器(如UV-Vis、荧光、光散射和质谱)结合的能力，有助于使LC成为生物制药关键质量属性常规分析的理想工具。

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