液相色谱——包括高效液相色谱法、UHPLC LCxLC

液相色谱法是什么?

液相色谱(LC)是一个色谱技术用于分离和分析的混合物溶液中的化学成分,确定是否一个特定的组件存在或者不存在,如果存在,有多少的。我们中的许多人都熟悉的一种形式平面LC从我们的学生时代,做一个黑色墨水标记在滤纸上,蘸水和结束 看油墨内的组件的颜色分开 水的吸收。然而,分析应用程序中使用的大多数信用证是基于柱层析法,将关注的焦点。高效液相色谱法(HPLC),顾名思义,是用于高性能变体高效分离色谱分辨率高。分离组件也可能孤立后检测的净化,使用馏分收集器。高效液相色谱法可在各种不同的配置和用于溶解成分的分离分子量从挥发性小分子蛋白质生物分子大的几个数万kilodaltons。

液相色谱法是一个非常受欢迎的分析技术用于许多应用程序包括但不限于:

• 环境监测
• 饮用水的分析
• 食品安全与质量控制
• 空气质量分析
• 化学工业测试
• 临床诊断包括新生儿筛查
• 制药和生物制药分析
• 筛查药物滥用

液相色谱是如何工作的呢?

各种不同的系统配置可用于液相色谱仪,效率最高的分离上运行超高液相色谱法(UHPLC)仪器,这种技术在2004年首次商业化和被称为超高效液相色谱(UPLC)。简而言之,这是多组分的混合物溶于液体流动相分离是由于单个组件的独特的分区之间的流动相(图1(1))和固定相(列)(3)(图1)。

流动相,一般溶剂,用于运输样品通过系统借助高压泵(1)(图1)。然而,它也在分离过程中起着至关重要的作用。

样品的体积小(1 - 100µL)加载到一个示例循环(图1(2)),然后注入流动相流通过六端口阀触发色谱运行的开始。一旦样品被注入,流动相被泵到列(图1 (3))。各种列长度(30 - 250毫米)和内部直径4.6毫米(1)可用,挤满了固定相吸附剂材料的不同活动和粒子大小(1.5 - 10微米直径)一起定义列效率和选择性。列位于柱温箱;在高温(45ºC)流动相的粘度增加而减少它的线速度。这反过来又降低了运行时间,也提高了色谱的分辨率。

组件有高亲和力的混合流动相将通过列快速迁移与固定相交互。如组件的乐队树叶或洗提列,探测器(图1)(4),将反应组分的浓度成正比。之间的时间注入和检测被称为保留时间。组件的保留时间将非常具体的对于一个给定的色谱条件和可能与鉴定的标准。

在反相色谱法的情况下,减少极性分析物将优先分配到非极性固定相保留时间较长。的数据采集系统(图1(5))记录探测器响应的函数在色谱保留时间。的峰值记录色谱图(图2)通常是综合确定峰面积与浓度成正比的组件存在于样品。

图1: 液相色谱仪的简化图用连字符连接到一个质谱仪(质)显示:(1)二元流动相泵,(2)autosampler 6-port阀和喷油器循环,(3)列与列加热器,(4)质谱检测器,(5)电脑。来源:Anthias咨询。

autosampler后注入样品流动相的分离过程进行了列。色谱系统的选择性对色谱分辨率有最大的影响力,应该为应用程序和组件在调查之中。选择性可能修改通过改变流动相的eluotropic强度(不同溶剂)或特定的化学官能团存在于固定相(改变列类型)。

图2 :从一个高效液相色谱或质色谱图输出。信贷:Anthias咨询

考虑到流动相,主要有两种模式可供选择的操作运行时液相色谱仪,即权力平等主义的或梯度。一个权力平等主义的方法将使用相同的流动相组成色谱运行期间没有选择性的变化。梯度法将使流动相组成变化作为时间的函数,通常优化色谱分辨率增加或缩短运行时间。

固定相的化学固定在柱的选择性影响的技术。反相高效液相色谱法或UHPLC¹是最受欢迎的系统配置和使用非极性固定相,如以(ODS或使用C18),和一个极性流动相(水/甲醇)。其他反相固定相包括octasilane (C8)与相应的短不如C18疏水性低极性分析物的保留时间。如果使用一个列,携带酚取代基,这将增加酚醛成分的保留由于他们的亲和力增加;物以类聚。

流动相的pH值有一个深远的影响离子的保留时间组件,这应该是杠杆方法开发过程中。缓冲区²可用于维持流动相两个单位的pH值低于pK离子的组件进而转变它的离解平衡中性形式。组件的中性形式会减少极性,因此它的保留时间可以控制。

正相色谱分离分析物是另一个LC方法基于他们的极性和实际上是发达之前引入反相液相色谱但不太受欢迎。正相色谱的固定相是极性³和非极性流动相。这改变了保留系统的特征,与非极性成分混合物淋洗第一最短的保留时间。极性分析物有高亲和力的固定相,洗提后不再保留时间。还有其他类型的液相色谱可以包括离子色谱法,包括离子交换和离子对、大小排斥、亲和力和的例子不胜枚举。除了尺寸排阻色谱法,分离分析物基于他们的大小/形状或分子量,所有提到的其他形式的信用证使用不同的移动和固定相化学反应。选择性和色谱分辨率可以达到给定的组件定义分离的固定和移动阶段。

组件,一旦分开,需要检测。的选择探测器是由应用程序的方法的目标;各种选项的不同程度的敏感性,特异性、选择性、线性动态范围。最受欢迎的检测器可见-紫外可见)探测器测量光在特定波长的吸光度。波长选择基于组件的λ马克斯分析,探测器响应的浓度成正比,特定的组件。当组件洗提列的流动细胞内浓度检测器将上升和下降,这反过来是绘制色谱峰(参见图2)。数据采集率应该设置为获得至少20个数据点的峰值。与如此多的色谱技术,用连字符号连接到质谱系统通常提供了最好的分析解决广泛的选择。

油管的长度和内部直径的各种组件用于互连LC系统至关重要,应该控制到最低。任何色谱系统的一部分,从喷射循环的开始到结束的探测器流动细胞,这不是固定相不为一个有效的分离。这些额外的体积在系统被称为空白卷,附加纵向孔隙中的扩散分离的组件将导致损失的敏感性和色谱分辨率降低。

从高效液相色谱UHPLC的进化

UHPLC的进化的主要原因是分析师的不断增加的要求更高分辨率的分离日益复杂和富有挑战性的样本。的重大突破,使这一步变化sub-2-micron固定相的色谱性能开发包装材料⁴粒度分布窄。

新粒子制造具有相同的化学功能的常用的选择性高效液相色谱固定相,保证色谱系统维护时使用相同的流动相。明显的性能优势是实现提高效率或平皿计数提供在使用新的接头2微米包装材料。

有很多优势看哪在迁移高效液相色谱方法到UHPLC系统包括运行时间短,色谱分辨率更高,增加灵敏度和溶剂消耗少。为了使用小说UHPLC列有必要使用一个泵,可以运行在更高的压力为了适应增加背压产生更小的微粒在列。探测器流细胞还需要升级到内部体积较小,这是必要的检测组件的窄波段淋洗柱。数据采集速率也需要相应地增加整个山峰,以确保足够的数据点。

液相色谱质谱(断字的质)

质谱分析可以说是最好的检测器,可以用连字符连接液相色谱仪由于其灵敏度高,线性动态范围,使用仪器时甚至选择性和特异性非常高质量的分辨能力。质谱技术用于确定质荷比(m / z)的组件或分析物。与气相色谱分析-质谱法(gc - MS),断字的LC系统并不容易,把女士多年来培养。电喷雾电离(ESI)是最常见的电离技术用于质今天,电离过程发生在大气压力的地方。它的发展是一个大气压力入口在质谱所需的高真空系统难以实现。微流和低流量质证明是有用的生物标志物检测和生物制药等领域的分析。

如何读一个质质谱,它告诉你什么?

电喷雾电离是一个非常软电离技术意味着很少有碎片离子的形成过程中观察到。质系统可能在正离子模式下运行的基本分析物生成质子化了的分子[M + H]⁺或负离子模式生成deprotonated酸性分析物分子(mh)^{- - - - - -}。

是有可能的碎片离子电喷射产生的过程通常是通过碰撞诱导解离(CID),以获得更多的信息特征和目标分析物的识别。CID可能在离子源中执行通过改变电位差应用于第一个抽样或漏杓锥,或者,在碰撞细胞离子加速到一个碰撞气体氩等。

图3是一个全扫描质与将收购碰撞诱导解离产生的一系列特征碎片离子为每个分离组件的混合物。质荷比(m / z)是沿着x轴绘制和强度或离子的相对丰度沿y轴绘制。z轴图3表示保留时间的分离组件,每个色谱峰基线解决由质谱仪分析一次,关键诊断碎片离子可以用于识别和目标离子确认。

图3: 一系列的全扫描质质谱,增加了一个额外的维度信息。来源:Anthias咨询。

以液相色谱为多个维度

在处理复杂的多组分的混合物,它不可能基线解决每一个组件作为单独的峰洗脱柱。方法开发和优化只能让你到目前为止,如果色谱分辨率不可用由于缺乏选择性则可能需要使用一个额外的色谱柱与另一种选择性分离co-eluting组件。

多维色谱法⁵允许转移co-eluting组件通过一个“心”到另一个色谱柱使用更合适的选择性,可以解决分离成单个淋洗组件。系统可以设置一个分流阀,简单地转移co-eluting峰值检测后在第一维度或列到第二维度,为后续分离和检测色谱分辨率更高。多维LC的改进功能已被证明有用的在许多领域包括foodomics,食品安全和可追溯性。

Semi-preparative液相色谱纯化

通过扩大维液相色谱系统,使用列和一个更大的内部直径达到更高的流量,可以加载更多的物质在列。Semi-preparative色谱法⁶系统可能含有100毫克的样本。然后用于收集馏分收集器的色谱峰为独立的瓶洗提列。馏分收集器是由检测器,色谱基线中寻找一个拐点指示峰的开始,收集和分离的峰组件作为纯粹的分数。孤立的分数可以接受额外补充质谱分析技术,如核磁共振(NMR),为了充分描述一个复合结构说明。

液相色谱法的优点和局限性

LC经常用于各种各样的应用程序;但是,它不适合挥发性化合物的分离和分析。鲁棒分析LC方法只能当所有的组件实现分离较低蒸汽压比流动相。气相色谱法更好的适合挥发性化合物的分析。一些生物制药已被证明具有挑战性的信用证的性质分析。然而,先进的设备和技术帮助克服这些问题。

广泛的数组不同的列和溶剂可提供广泛的选择性,使组件分离各种极性。大、小分子也同样适合这种技术。执行高效分离的能力在较低温度下也使LC理想分离技术对热不稳定的化合物可能分解气相色谱仪。

用液相色谱常见问题

样品制备是关键成功;是非常重要的,所有的样品都是过滤加载到autosampler之前。在处理UHPLC时,这尤其重要,高效分离使用下标2微米粒子在列容易阻塞如果样品没有过滤。同样适用于流动相,特别是当使用缓冲区。

正确的注射或稀释溶剂的使用示例是至关重要的,溶剂强度应该相同或低于起始条件的流动相。如果使用过于强烈的溶剂,然后峰分裂和再现性差将观察到的。可以观察到类似的问题,如果太强autosampler使用清洗溶剂。

获得的色谱图的基线波动或再现性差的保留时间很可能导致泵的问题(图1(1))或真空脱气装置。如果泵或真空脱气装置不是很好的维护,一个止回阀可能会成为部分卡将引起压力脉动。这些问题可以解决,随后进行预防性维护任务按照制造商的指导方针,以防止计划外停机时间和表现不佳。色谱图可以提供信用证的问题线索。

引用

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3所示。库珀WT,正相液相色谱。:分析化学的百科全书。美国癌症协会;2006年。doi:10.1002/9780470027318. a5913

4所示。易卜拉欣D, Ghanem a下标2μm二氧化硅粒子手性分离。微型和纳米材料的新用途,IntechOpen。doi:10.5772 / intechopen.79063

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